Ce protocole ATAC-seq modifié introduit un nouveau tampon de lyse qui diminue la contamination des lis mitochondriales de 50% à moins de 3%La diminution de la contamination mitochondriale permettra aux chercheurs d’effectuer un ATAC-seq plus efficace avec une diminution de 50% des coûts de séquençage. Nous avons validé ce nouveau protocole ATAC-seq chez les PBMCs primaires humains, les monocytes primaires humains, les cellules dendritiques de souris et les lignées cellulaires du mélanome. Nous croyons qu’il sera efficace dans un large éventail de types de cellules.
Il est essentiel de minimiser la perte d’échantillon pendant le processus d’activation et de sélection des cellules pour obtenir des résultats de haute qualité avec ATAC-seq. Nous démontrerons comment manipuler un petit nombre de cellules à partir d’échantillons précieux à l’aide d’équipement de laboratoire de base. Pour commencer, décongelez un flacon de cellules CD4+T précédemment isolées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la glace ait fondu.
Ensuite, transférez doucement les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de RPMI complet préchauffé. Centrifuger les cellules à 1500 fois G, et quatre degrés Celsius, pendant six minutes. Puis jetez le supernatant, et resuspendez doucement la pastille en deux millilitres de RPMI complet.
Après avoir répété la centrifugation, jeter le supernatant, et doucement resuspendre les cellules en 0,5 millilitres de RPMI complet. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. À l’aide d’un RPMI complet, réglez la densité de la suspension cellulaire à la plaque 50 000 cellules CD4+, en 200 microlitres par puits d’une plaque à fond rond de 96 puits.
Ensuite, pour préparer des perles magnétiques, aliquot 12,5 microlitres de perles humaines T-Activateur CD3/CD28 par échantillon ATAC-seq à un tube de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de 1x PBS au tube, et le placer sur un aimant pendant une minute pour laver les perles. Retirez et jetez soigneusement le surnatant clair et retirez le tube de l’aimant.
Resuspendez les perles dans 13 microlitres de RPMI complet par échantillon ATAC-seq. Pour activer les cellules CD4+T avec la concentration ajustée, recueillir 500 000 cellules dans 2,1 millilitres de milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 12,5 microlitres de perles human t-activateur, préparées et lavées dans les étapes précédentes, et mélanger délicatement en inversant le tube.
Ensuite, transférez doucement les cellules, avec des perles, dans un réservoir stérile. À l’aide d’une pipette multicanal, plaquez 200 microlitres de cellules avec des perles par puits d’une plaque ronde de 96 puits et incubez dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de CO2 à 5 % pendant 48 heures. Après incubation complète, centrifuger la plaque à 423 fois G, et température ambiante, pendant huit minutes.
Retirer 100 microlitres de milieu de chaque puits et les recueillir dans un tube conique avant de les jeter, afin de confirmer qu’il n’y a pas de perte de perles. Puis résuspendez la pastille cellulaire dans les 100 microlitres restants de milieu, et de recueillir tout dans un tube de 1,5 millilitre. Pour isoler les cellules CD4+, ajouter 50 microlitres de perles conjuguées CD4 prélavées à 500 000 cellules dans un millilitre de RPMI complet, et inverser pour mélanger.
Incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, tout en feuilletant à la main toutes les six minutes pour mélanger. Placez le tube sur l’aimant pendant deux minutes, jusqu’à ce que le surnatant soit clair, puis retirez et jetez. Retirez le tube de l’aimant.
Lavez les cellules liées aux perles en les réutilisant dans un millilitre de PBS, plus 2% FCS, et placez le tube sur l’aimant pendant une minute. Jetez le supernatant clair, et répétez ce processus pour un total de trois lavages. Après le lavage final, placez le tube sur l’aimant pendant une minute.
Retirez-le, jetez le surnatant et placez la pastille sur la glace. Ensuite, pour effectuer l’isolement des noyaux, résuspendez les perles et les cellules dans 50 microlitres de tampon de lyse froide, et centrifugeuse immédiatement à 500 G, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes. Retirer et jeter le surnatant.
Pour effectuer la réaction de transposase, resuspendez la pastille de noyaux isolée avec 50 microlitres de mélange de transposase Tn5. Incuber dans un thermocyclre pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, avec le couvercle réglé à 40 degrés Celsius, puis tenir à quatre degrés Celsius une fois terminé. Immédiatement après le thermocyclisme, effectuez une centrifugeuse rapide.
Placez le tube sur l’aimant pendant une minute pour enlever les perles du produit. Sans enlever le tube de l’aimant, transférez le supernatant clair dans une colonne de purification de l’ADN. Lavez la colonne une fois avec 250 microlitres de tampon PB, et deux fois avec 750 microlitres de tampon PE.
Ajouter ensuite 10 microlitres de tampon d’élitution pour élucider l’échantillon. Configurer la réaction initiale d’amplification pcr dans un tube PCR sans nucléase. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR.
Ensuite, complétez l’amplification pcr finale des 45 microlitres restants de réaction PCR, tel que décrit dans le manuscrit. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme. Après amplification complète, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR, suivant le protocole du fabricant, en 25 microlitres du tampon d’élitution.
Séquencez les bibliothèques préparées sur un séquenceur de nouvelle génération à une profondeur de lecture moyenne de 42 millions de lecture par échantillon. Ce protocole ATAC-seq amélioré a produit une bibliothèque finale de plus d’un nanogramme par microlitre pour le séquençage. Le contrôle de la qualité a montré des fragments d’ADN entre 200 et 1000 paires de base, et d’autres séquençages ont été effectués avec ces bibliothèques de haute qualité.
Les bibliothèques préparées à la suite de ce protocole n’ont montré qu’une contamination mitochondrique de 3 %. Le pourcentage élevé de lectures utilisables est suffisamment constant entre les répliques biologiques. Ce protocole a fourni des résultats hautement reproductibles à travers des répliques techniques, ainsi que des répliques biologiques.
En outre, ce protocole a pris 48 heures, plutôt qu’une semaine ou plus comme décrit précédemment, ayant pour résultat l’activation cohérente et efficace, comme démontré par des résultats reproductibles de séquençage. De plus, le pipeline d’analyse a appelé avec précision les pics prévus d’ATAC-seq. L’analyse des résultats de séquençage a révélé des changements clairs dans l’état de chromatine pendant l’activation humaine des cellules T.
Des régions différemment accessibles de chromatine ouverte ont été identifiées entre six échantillons avant et 48 heures après l’activation. Assurez-vous que la réaction de lyse des noyaux est effectuée avec des reagents et des matériaux réfrigérés, afin de maximiser la récupération des noyaux intacts. Notre tampon de lyse de noyaux modifiés est plus doux sur les cellules, et minimise la contamination de l’ADN mitochondrial.
Nous attendons avec intérêt que ce tampon modifié de lyse soit appliqué aux noyaux simples ATAC-seq aussi bien. Nous savons que ce protocole permettra aux chercheurs de produire des données ATAC-seq de meilleure qualité à un coût réduit, ce qui aidera à faire avancer le champ épigénétique. Le protocole est simple, rapide et ne nécessite aucun réaccélément ou instrument dangereux, ce qui le rend facilement accessible aux nouveaux atac-seq.
