Ce protocole permet l’assemblage informatisé de séquences oligomériques par des interactions covalentes dynamiques, imitant véritablement l’hybridation séquence sélective des acides nucléiques, mais avec une force de liaison interstrand accrue. Les assemblages covalents dynamiques sont généralement limités à des architectures simples en raison de leur capacité limitée de réarrangement des liaisons et de correction des erreurs. En revanche, en augmentant le long de la concentration d’un acide Lewis pour affecter la dissociation des liaisons et catalyser par la suite le réarrangement des liaisons, cette technique atténue les limites cinétiques répandues de piégeage des systèmes d’auto-assemblage.
Cette méthode pourrait être utilisée dans une variété de domaines qui utilisent des réactions de réarrangement des liaisons covalentes, des cadres organiques covalents avec des taux de défaut exceptionnellement faibles aux interfaces tissulaires biomatériales qui sont capables de s’adapter et de s’adapter au remodelage continu du substrat tissulaire. Lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, les individus peuvent trouver des assemblages kinétiquement piégés, même après des temps d’annealage prolongés. Nous conseillons aux utilisateurs pour la première fois de tenter des hybridations entre oligomers portant exclusivement de l’aldéhyde et exclusivement des résidus d’amine, en simplifiant les informations codées et donc l’hybridation.
Pour commencer cette procédure, pesez 0,125 grammes de résine de soutien solide photolabile FMOC et ajoutez-la à un récipient de réaction de synthétiseur automatisé fritté. Insérez le récipient dans la partie micro-ondes du synthétiseur. Remplissez la bouteille principale de solvant avec DMF et la bouteille de dépprotection avec une solution de 20%4-méthylpiperidine dans DMF et videz les déchets.
Ensuite, préparez une solution molaire d’acide bromoacétique et de DIC en DMF avec des volumes totaux de 1,5 millilitres pour chaque résidu dans l’ordre et 0,47 millilitres d’anhydride acétique à 4,53 millilitres de DMF pour faire une solution de plafonnement de cinq millilitres. Préparez 0,5 solution molaire de chaque amine primaire à utiliser dans le PNM. Le volume total de chaque solution devrait être de 2,5 millilitres pour chaque résidu de l’amine primaire appropriée plus 2,5 millilitres supplémentaires.
Ajoutez toutes les solutions au collecteur de synthétiseur automatisé. À l’aide d’un synthétiseur peptidique automatisé, gonflez la résine, fendez le groupe FMOC et effectuez la réaction de déplacement décrite dans le protocole textuel. Après cela, saliniser les murs d’un récipient de réaction en verre fritté équipé d’un robinet d’arrêt à trois sens en le remplissant vers le haut avec une solution de 5%dichlorodimethylsilane en DCE.
Laissez reposer pendant 30 minutes, puis égouttez le récipient et lavez-le avec du DCE et du méthanol. Une fois le récipient sec, transférez-lui la résine. Lavez la résine trois fois avec du DCM à l’aide de cinq millilitres pour chaque lavage tout en bouillonnant de gaz azoté à travers un bras et en tirant le vide avec un autre.
Sécher et conserver la résine et l’oligopeptoid attaché jusqu’à ce que la dépprotection et le clivage. Lorsqu’elle est prête à continuer, gonflez la résine si elle a été stockée pendant plus d’une journée en la bouillonnant de cinq millilitres de DMF pendant 10 minutes. Égoutter le récipient et ajouter une petite barre magnétique et trois millilitres de DCM sec au récipient en verre peptidique.
Pesez 0,1 équivalent du catalyseur de palladium et 25 équivalents de phénylésilane par groupe alloc. Utilisez une pince pour positionner le récipient de réaction à un angle au-dessus de la plaque de remue-remuer de sorte que la résine subit une légère agitation tout en restant suspendue dans le solvant et capuchon du navire pour empêcher le DCM de s’évaporer. Après une heure, filtrer la solution et laver la résine trois fois avec DCM à l’aide de cinq millilitres par lavage.
Ensuite, répétez la dépprotection alloc une fois de plus. Ensuite, rincez la résine séquentiellement avec du méthanol et du DCM deux fois et transférez la résine et la barre magnétique à remuer sur un flacon de 20 millilitres. Submergez la résine dans DMF, remuer et fendre comme indiqué dans le protocole de texte.
Ensuite, utilisez un filtre seringue pour séparer l’oligopeptoid libéré de la résine et enlever le solvant sous vide. Reconstituer les peptoïdes dans un mélange 50-50 d’eau et d’acétyonitrile et purifier avec hplc préparatif de phase inversée. Mélanger les fractions purifiées, puis congeler et les lyophiliser pour donner une poudre blanche.
Analyser la poudre avec la spectrométrie de masse ESI et MALDI. Pour évaluer la pureté, effectuez hplc analytique des oligopeptoids purifiés. Tout d’abord, préparer des solutions de stock de 10 millimolaires de chaque séquence oligopeptoid utilisé pour l’auto-assemblage et une solution de stock de 10 millimolaires de triflate de scandium dans l’acétyonitrile anhydre.
Ajouter 20 microlitres de chaque solution de bouillon peptoïde à un flacon de trois millilitres équipé d’une barre magnétique. Ajouter 1,5 équivalent de la solution de triflate de scandium par liaison potentielle d’amine de la solution de stock et ajouter assez d’eau et d’acetonitrile pour former 200 microlitres d’une solution d’eau et d’acétyonitrile de 2%. Remuer délicatement à 70 degrés Celsius pendant deux heures pour la déptection de l’aldéhyde en acétyl et la dissociation de tous les brins.
Après cela, chargez le flacon avec 200 microlitres de chloroforme et deux millilitres d’eau. Agiter doucement le flacon. Laisser reposer le mélange pendant au moins 15 minutes.
Lors de la séparation complète de la phase, extraire la couche organique à l’aide d’une seringue microlitre. Transférer la couche organique sur un nouveau flacon et remuer à 70 degrés Celsius pour l’annealage oligomer qui prend généralement six heures. Pour démontrer la capacité des peptoïdes codés par l’information à subir l’auto-assemblage covalent dynamique séquence-sélectif dans des échelles moléculaires, un brin représentatif est synthétisé et hybridé avec sa séquence peptoïde complémentaire.
Les monomères NPAM et NPAL sont utilisés comme paires dynamiques de réaction covalentes avec NEEE qui aident à la solubilité des produits auto-assemblés finaux. Une fois la synthèse du submonomer en phase solide terminée, le groupe alloc est supprimé. Avant et après la dépprotection, des parties de la résine ont été fendées sous la lumière de 405 nanomètres et caractérisées par la spectrométrie de masse d’ionisation d’électrospray.
La séquence est purifiée par hplc de préparation, puis lyophilisée pour réaliser une poudre blanc éteint et la pureté est confirmée avec HPLC analytique. L’oligopeptoid est par la suite hybridé avec sa séquence complémentaire pour se permettre une échelle d’enregistrement confirmée par MALDI-MS. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas de laisser suffisamment de temps pour les couches complètement séparées jusqu’à ce que la fraction aqueuse devienne transparente, au moins 15 minutes pour assurer une extraction suffisante du catalyseur.
Après avoir terminé cette procédure d’assemblage, la spectrométrie de masse doit être effectuée pour déterminer l’étendue de l’hybridation. En outre, la spectrométrie de masse de plasma inductivement couplée ou le NMR de fluor peut être employé pour évaluer la concentration de scandium post-extraction. Bien que cette technique ait été récemment mise au point, nous prévoyons que l’approche biomimétique décrite dans nos travaux jouera un rôle déterminant dans la direction de la conception future et de l’assemblage de nanostructures complexes dirigées par l’information.
Plusieurs des reagents utilisés ici sont dangereux. S’il vous plaît faire preuve de prudence lors de la manipulation de ces produits chimiques ou tout autre. Portez tout l’équipement de protection individuelle et effectuez toutes les expériences à l’intérieur d’une hotte de fumée.
