Ce protocole vous montrera comment tacher les microglies, effectuer des analyses quantitatives de densité et de morphologie ainsi que quantifier l’infiltration de macrophages dans le cerveau. Cette technique permet au chercheur de mesurer les changements dans la distribution et la morphologie des microglies d’une manière quantitative et de différencier les microglies des macrophages infiltrants Ce protocole d’analyse peut être facilement appliqué à d’autres modèles animaux pour mesurer les changements dans la distribution et la morphologie microgliales où des anticorps anti-IBA1 et anti-TMEM119 sont disponibles. Il est fortement recommandé d’effectuer les dénombrements cellulaires et les traces aveugles à l’état expérimental et d’être cohérent dans la façon dont cette procédure est effectuée.
Pour commencer cette procédure, ouvrez un programme de traitement d’image tel que Fidji ou ImageJ qui a le voisin le plus proche plug-in distance installé. Ouvrez l’image 20X si l’échelle est contenue dans les métadonnées du fichier et non pas automatiquement définie à partir des métadonnées. Sur la barre de menu, sélectionnez Analyser, Définir l’échelle, puis entrez les informations correctes.
Pour définir l’échelle manuellement en fonction d’une échelle imprimée sur l’image, sélectionnez l’outil Straight Line. Placez le curseur sur le bord de l’échelle et tout en appuyant sur la touche Shift, tracez une ligne aussi près que possible de l’échelle sur l’image. Sélectionnez Analyser, Définir l’échelle.
Une fenêtre apparaîtra et mettra la bonne distance connue et l’unité de longueur pour déterminer l’unité par longueur du pixel et cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez Image, Couleur, Make Composite pour créer une image composite de tous les canaux. Sur la barre de menu, sélectionnez Analyser, Définir les mesures. Check Area, Centroid et Perimeter.
Dans le menu Redirect To dropdown, sélectionnez le fichier Open puis cliquez sur OK. Passez à l’image, la couleur, l’outil canal pour ouvrir l’outil Canal. Utilisez l’outil sélection à main levée pour dessiner un périmètre rugueux autour de la région d’intérêt. Double cliquez sur l’outil Ovale sur la barre d’outils pour activer l’outil brosse de sélection.
Assurez-vous que la case Activer la brosse de sélection est cochée et cliquez sur OK. À l’aide de la brosse de sélection, ajustez le périmètre pour mieux s’adapter à la région d’intérêt, puis appuyez sur T sur le clavier dans toute cette zone pour flècher Y manager. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la touche M et la fenêtre Résultats apparaîtra. Copiez et coller les résultats dans une fiche de données et enregistrez les informations concernant la zone.
Après avoir copié la zone de la région d’intérêt, vous basez les informations de la fenêtre Résultats en cliquant dessus et en appuyant sur la clé Backspace. Sélectionnez la fenêtre ROI Manager, sélectionnez la trace roi et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez sur OK puis cliquez à droite sur le nouveau nom de la trace roi et enregistrer.
Cliquez deux fois sur l’outil Brosse dans la barre d’outils. Sélectionnez la couleur noire et la taille de la brosse de 10. Assurez-vous que l’option Peinture sur superposition n’est pas contrôlée.
Dans le canal TMEM119, placez soigneusement un point noir au centre du soma pour chaque microglie positive TMEM119. Placez un point blanc sur le centre des cellules qui ne sont pas positifs pour TMEM119. Répétez la même procédure pour toutes les cellules contenues dans la région d’intérêt.
Ensuite, sélectionnez Image, Couleur, Split Channel, une fenêtre pour chaque canal s’affiche. Identifiez le canal qui a les annotations de points et fermez les deux autres fenêtres. Pour rediriger la nouvelle image du canal fractionnement, rendez-vous sur Analyser, définir les mesures.
Dans le menu Redirect To drop down, sélectionnez l’image split channel et cliquez sur OK. Sélectionnez ensuite Image, Type, huit bits. Passez à l’ajustement d’image et sélectionnez Seuil. Ajustez les curseurs jusqu’à gauche dans les deux barres.
Cela ne laissera que les points noirs qui apparaîtront maintenant en blanc. Sélectionnez la région d’intérêt dans la fenêtre roi manager. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser, analyser les particules.
Dans la boîte de texte pour la taille, entrez un à 20. La case pour les unités Pixel doit rester non cochée tandis que la case qui est pour les résultats d’affichage, résumer et ajouter au gestionnaire doit être cochée. Cliquez sur OK pour afficher la fenêtre Résumé qui donnera le nombre de points.
Copiez et coller ces informations à la fiche de données. Ensuite, sélectionnez plug-ins NND pour afficher la fenêtre NND. Chaque nombre représente la distance que chaque microglie a par rapport aux microglies voisines les plus proches.
Copiez et coller toutes ces informations à la fiche de données. Retournez à la fenêtre Seuil et ajustez le curseur supérieur jusqu’à droite, ce qui laissera tous les points blancs visibles, apparaissant maintenant en blanc. Sélectionnez Analyser, analyser les particules pour afficher la fenêtre Analyser les particules.
Cliquez sur OK pour afficher la fenêtre Résumé qui fournit le nombre de points. Copiez et coller ces informations dans la fiche de données. Rendez-vous sur le gestionnaire de retour sur investissement et sélectionnez tous les points.
Puis cliquez à droite et enregistrez avec le nom de l’image. Cela permettra d’enregistrer tous les points dans un fichier ZIP. Tout d’abord, ouvrez les fichiers d’images 4DX.
Une fenêtre pop up apparaîtra demandant si les images doivent être ouvertes dans une pile. Cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez Image, Piles, ZProject pour ouvrir la fenêtre de projection Z. Inclure toutes les tranches de la première à la dernière tranche.
Assurez-vous que l’intensité maximale est sélectionnée sous le type de projection et cliquez sur OK. Cliquez sur la nouvelle fenêtre qui contient le ZProject. Sélectionnez Image, Couleurs, Canaux Fractionnements et effectuez les traces sur les images du canal IBA1. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser, définir les mesures.
Vérifiez la zone, centroïde et périmètre. Dans le menu Redirect To drop down, sélectionnez le fichier ouvert et cliquez sur OK. Pour définir l’échelle manuellement en fonction d’une échelle imprimée sur l’image, sélectionnez l’outil Straight Line. Placez le curseur sur le bord de l’échelle et tout en appuyant sur la touche Shift, tracez une ligne aussi près que possible de l’échelle sur l’image.
Sélectionnez Analyser, Définir l’échelle. Une fenêtre apparaîtra. Entrez la distance et l’unité de longueur connues correctes pour déterminer l’unité Pixels par longueur et cliquez sur OK. Pour mesurer la taille du soma dans le canal IBA1, dessinez un périmètre rugueux du soma avec l’outil de sélection à main levée.
Cliquez deux fois sur l’outil Ovale sur la barre d’outils pour activer l’outil Selection Brush. Assurez-vous que la case Activer la brosse de sélection est cochée et cliquez sur OK. À l’aide de la brosse de sélection, ajustez la trace pour mieux s’adapter au soma. Le zoom avant permettra une précision pendant cette étape.
Ensuite, appuyez sur la clé T pour ajouter la trace soma au gestionnaire de roi. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la clé M pour afficher les résultats. Copiez et coller ces résultats sur une fiche de données.
Rendez-vous à la fenêtre roi manager, sélectionnez la région d’intérêt et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez à droite sur la région d’intérêt rebaptisée et cliquez sur Enregistrer. Assurez-vous que le nom spécifie que la trace est pour soma et enregistrer le fichier.
Pour mesurer la zone d’arborisation dans le canal IBA1, sélectionnez d’abord l’outil de sélection polygone. Cliquez sur l’extrémité du processus microglial avec l’outil pour commencer la forme du polygone. Faire le tour des microglies en cliquant sur les extrémités de chaque procédé pour former un polygone qui représente le mieux la zone couverte par les arborisations microgliales.
Lorsque le polygone est terminé, cliquez sur le point de départ pour le fermer. Ensuite, appuyez sur la touche T pour ajouter la trace au gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la touche M pour ajouter les données à la fenêtre Résultats.
Copiez et coller ces données à la fiche de données. Pour enregistrer les informations concernant la zone d’arborisation, rendez-vous à la fenêtre roi manager, sélectionnez la région d’intérêt et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez à droite sur la région d’intérêt rebaptisée et cliquez sur Enregistrer.
Assurez-vous que le nom précise que la trace est pour l’arborisation et enregistrer le fichier. Cette étude a décrit le flux de travail étape par étape pour la co-coloration immunofluorescente d’IBA1 et tmem119 et pour l’analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales ainsi que de l’infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu cérébral de souris. La microscopie par fluorescence est utilisée pour imager le co-étiquetage des microglies à l’aide d’IBA1 et tmem119 dans la section coronale de l’hippocampe dorsal au grossissement 20X.
Une coloration réussie révèle les corps cellulaires microglials et leurs processus fins. La coloration permet de déterminer la densité et la distribution microgliales et d’identifier les grappes microgliales et les macrophages infiltrants. La microscopie confocale est utilisée pour l’image de la procédure de traçage de l’arborisation microgliale stepwise au grossissement 40X.
Ces résultats représentatifs montrent IBA1 microglies positives et TMEM119 positives ainsi qu’un exemple de traçage du corps cellulaire. Il est important d’être cohérent lors du comptage des cellules et de prêter attention aux signaux d’IBA1 et de TMEM119. Cette technique permet au chercheur d’identifier les régions du cerveau qui sont affectées par un stimulus particulier qui peut ensuite être étudié plus en profondeur avec des techniques complémentaires.
