Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés sur l’hétérogénéité et les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales amniotiques humaines isolées de la membrane amniotique. Tandis que les protocoles précédents ont isolé des cellules de la membrane co-amniotique sans discerner entre les régions, notre protocole permet la culture de la population cellulaire isolée de trois régions anatomiques distinctes. Pour séparer la membrane amniotique par région, dans un cabinet de biosécurité dans des conditions stériles, identifier l’amnion ombilical enveloppant le cordon ombilical, l’amnion placentaire couvrant la decidua basalis, et la région réfléchie, qui est considérée comme le reste de l’amnion qui n’est pas attaché au placenta.
Pour disséquer la région d’amnion ombilical, utilisez des forceps disséquants pour tenir la partie de la membrane d’amnion qui recouvre la jonction du placenta et du cordon ombilical, et utilisez un scalpel pour disséquer la région qui entoure le cordon, tout en s’étendant pour séparer la région de la chorion. Ensuite, déposez le tissu séparé dans un bécher étiqueté avec 100 millilitres de solution saline. Pour disséquer la région placentaire d’amnion, utilisez une gaze stérile de coton pour enlever les caillots sanguins de la surface de la chorion/amnion qui recouvre le placenta.
Et utilisez des forceps disséquants pour saisir la membrane à la frontière entre le placenta et la région réfléchie. Utilisez un scalpel pour couper le long de la circonférence du placenta et séparer l’amnion placentaire de la chorion, en prenant soin de ne pas couper les vaisseaux du placenta. Placez le tissu séparé dans un autre bécher étiqueté avec 300 millilitres de solution saline.
Et séparer le reste de la membrane amniotique qui n’est pas attachée au placenta de la chorion. Ensuite, placez la région réfléchie dans un autre bécher étiqueté avec 300 millilitres de solution saline. Pour laver les membranes, utilisez des pinces à épiler pour les placer sur une surface stérile afin de pouvoir jeter la solution saline de chaque contenant de tissu.
Remettre les membranes dans le récipient et ajouter 100 millilitres de solution saline fraîche à la région ombilicale et 300 millilitres de solution saline fraîche aux régions placentaires et réfléchies. Utilisez des forceps disséquants pour remuer les membranes pour éliminer tout résidu de sang et placer les membranes sur la surface stérile pour être en mesure de jeter les solutions salines. Ensuite, lavez les membranes au moins deux fois de plus, comme nous venons de le démontrer, jusqu’à ce que les tissus soient translucides.
Pour la digestion enzymatique des différentes régions de membrane amniotique, coupez les régions réfléchies et placentaires en deux ou trois fragments. Et placez les fragments et la région ombilicale dans des tubes de centrifugeuse individuels de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de trypsine-EDTA de 0,5 % à chaque tube de fragments de tissus de la région réfléchie et placentaire et cinq millilitres de trypsine-EDTA de 0,5 % au tube contenant le tissu de la région ombilicale.
Secouez doucement les tubes pendant 30 secondes. Placez ensuite les membranes sur une surface stérile, en jetant la solution trypsine-EDTA et remplacez-la par 30 millilitres de trypsine-EDTA fraîche de 0,5 % pour les fragments de tissus de la région réfléchie et placentaire et 15 millilitres de trypsine-EDTA frais de 0,5 % pour le tissu de la région ombilicale. Placez ensuite les tubes dans un rotateur à l’intérieur d’un incubateur pour une rotation de 40 minutes à 20 rotations par minute à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, transférer tout le volume de la solution cellulaire dans de nouveaux tubes coniques. Et ajouter deux fois le volume de 37 degrés Celsius cellules humaines AE moyen à chaque tube sur la glace. Digérer les restes de fragments de tissu dans les tubes d’origine avec frais 0,5%trypsine-EDTA, comme vient de le démontrer.
À la fin de la deuxième digestion, utilisez une paire de forceps disséquants pour tenir une extrémité de la partie amnion et une deuxième paire de forceps disséquants pour presser le long du tissu restant pour enlever toutes les rangées de cellules épithéliales qui ne se sont pas complètement décollées pendant les périodes d’incubation précédentes. Ensuite, retirez les membranes pour pouvoir transférer la deuxième solution de digestion à un deuxième ensemble de tubes de centrifugeuse. Et inactiver les enzymes de digestion avec deux fois le volume de 37 degrés Celsius frais milieu cellulaire humain AE sur la glace.
Pour l’isolement cellulaire de l’AE humaine, sédimenter les cellules par centrifugation. Et resuspendez la pastille dans chaque tube avec 10 millilitres de milieu frais de cellule humaine AE de 37 degrés Celsius. Tirez chaque paire de digestions dans un seul tube et filtrez les suspensions à travers des passoires de 100 micromètres pour enlever les débris de matrice extracellulaire.
Après comptage, ensemencer les cellules humaines d’AE de chacune des trois régions en plaques individuelles de 100 millimètres à une concentration de trois fois 10 à la quatrième cellule par centimètre au carré dans le milieu cellulaire humain d’AE de 37 degrés Celsius, complétée par 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique humain. Ensuite, incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans des conditions normoxiques dans un incubateur humidifié jusqu’à l’analyse en aval de l’intérêt. Après 48 heures de culture, les cellules AE humaines avec un phénotype épithélial adhèrent à la surface de la plaque, tandis que le supernatant contient des débris cellulaires et des cellules flottantes qui peuvent être enlevées une fois que le milieu est changé.
Il est conseillé de jeter les cultures et de traiter une autre membrane en identifiant la présence de contamination bactérienne, d’érythrocytes excessifs dus à un lavage insuffisant des membranes, de cellules déficientes ou non héherentes, ou de cellules ayant une morphologie fibroblaste. La morphologie cellulaire de l’AE humain dépend de l’origine des cellules, car les cellules de la zone réfléchie démontrent une morphologie cuboïde et se développent dans un monocouche pavé, et les cellules des régions placentaires et ombilicales sont plus plates et squameuses. L’immunofluorescence contre l’E-cadhérine révèle que les cultures primaires et les sous-cultures maintiennent leur phénotype épithélial, suggérant qu’il n’y a pas de contamination d’un autre type de cellule.
En outre, les cellules sont viables, comme en témoigne leur expression du marqueur de prolifération Ki-67. Bien que les sous-populations de l’amnion diffèrent dans leur morphologie et leur fonction, l’expression et la présence du noyau des facteurs de pluripotence ne changent pas dans les cellules humaines d’AE dérivées des régions placentaires et réfléchies. Puisque les cellules épithéliales amniotiques humaines sont une source possible de cellules souches pluripotentes, nous pouvons les défier par une ligne de protocoles de définition spécifiques pour élucider si ces cellules de chaque région ont des potentiels différents.
Avant un protocole commencé, passez en revue les antécédents médicaux du patient pour s’assurer que le tissu ne présente aucune caractéristique microbiologique de l’infection.
