Notre protocole peut être utilisé pour visualiser la complexité structurelle des organoïdes, permettant la cartographie de l’identité, du sulfate et de la distribution dans ces structures 3D à la résolution d’une seule cellule. Notre protocole rapide de trois jours est entièrement optimisé pour les organoïdes d’origine diverse et utilise une préparation d’échantillon simple, qui comprend une étape de compensation optique non toxique et une méthode de montage à base de silicium. Bien que notre protocole soit simple, certains d’entre eux sont des étapes critiques telles que la manipulation organisée, ou la préparation de diapositives, peut être mieux expliqué par la démonstration visuelle que par le texte.
Pour récupérer des organoïdes de 100 à 500 micromètres de diamètre cultivés dans l’extrait de membrane du sous-sol dans 24 plaques de puits, lavez chaque soudure pour la récolter avec du PBS sans perturber les matrices 3D et placez la plaque sur la glace. Ajouter un millilitre de solution de récupération glacée à chaque puits et placer la plaque sur un shaker horizontal à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Trempez un tuyaut millilitre dans un 1%BSA dans la solution PBS et pipette de haut en bas deux fois pour enduire chaque pointe avec BSA.
Ensuite, ajouter cinq millilitres de 1%PBS BSA à un tube de 15 millilitres par condition, et inverser le tube deux à trois fois avant de jeter la solution, pour enduire l’intérieur du tube. Pour recueillir les organoïdes, utilisez une pointe enduite pour suspendre doucement le contenu du puits cinq à dix fois, et tirez tous les organoïdes de chaque condition dans un seul tube enduit de 15 millilitres. Rincez chaque puits avec un millilitre de glace 1%PBS BSA pour s’assurer que tous les organoïdes ont été recueillis, et transférer les lavages dans les tubes appropriés.
Apportez le volume final dans chaque tube jusqu’à 10 millilitres avec PBS froid, et sédimentez les organoïdes par centrifugation pour obtenir une palette serrée sans une couche visible de matrice 3D. Pour fixer les organoïdes, utilisez une pointe de pipette enduire d’un millilitre pour suspendre soigneusement chaque granulé dans un millilitre de para formaldéhyde glacé et fixer à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Suspendre doucement les organoïdes à mi-cuisson.
Après 45 minutes, ajouter 10 millilitres de PBS glacé plus l’interpolation 20 à chaque tube et mélanger délicatement par inversion, avant de placer les tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour bloquer les organoïdes, à la fin de l’incubation, faites tourner les échantillons et suspendez les granulés dans au moins 200 microlitres de tampon de lavage organoïde glacé par puits à plaquer. Ensuite, transférez les organoïdes dans les puits individuels d’une plaque de suspension de 24 puits pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Pour l’immunolabeling ajouter 200 microlitres de tampon de lavage organoïde dans un puits de référence vide, et permettre aux organoïdes de s’installer au fond de la plaque. Lorsque les organoïdes se sont installés, inclinez la plaque à un angle de 45 degrés pour permettre l’enlèvement de tous les microlitres sauf les 200 derniers de tampon de lavage. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage organoïde contenant les principaux anticorps d’intérêt, et placez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un léger basculement et secouant à 40 révolutions par minute.
Le lendemain matin, ajouter un millilitre de tampon de lavage organoïde à chaque puits, et permettre aux organoïdes de s’installer au fond de la plaque pendant trois minutes. Lorsque les organoïdes se sont installés, retirez tous les microlitres sauf les 200 derniers de chaque puits, et lavez les organoïdes avec trois lavages de deux heures avec un millilitre de tampon de lavage organoïde frais, et un léger basculement et secousses par lavage. Après le troisième lavage, laisser les organoïdes s’installer au fond de la plaque pendant trois minutes avant d’enlever tous les microlitres de tampon de lavage organoïde sauf les 200 derniers de chaque puits.
Ajouter 200 microlitres de tampon de lavage organoïde contenant les anticorps secondaires appropriés à chaque puits pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius avec un léger basculement et des secousses. Le lendemain matin, lavez les organoïdes avec trois lavages de deux heures dans un millilitre de tampon de lavage organoïde frais par lavage, comme démontré. Après le dernier lavage, transférer les organoïdes dans un tube de 1,5 millilitre par puits, et recueillir les organoïdes par centrifugation.
Pour le dégagement optique des organoïdes, retirez autant de tampon de lavage de chaque tube que possible, sans perturber les organoïdes, et utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres modifiée pour ajouter au moins 50 microlitres de FUnGI à chaque granule. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, les organoïdes peuvent être conservés jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius, ou jusqu’à six mois à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer des diapositives pour l’imagerie organoïde par microscopie confocale, remplissez une seringue de 10 millilitres d’un scellant en silicone et fixez une pointe modifiée de pipette de 200 microlitres à la seringue.
Utilisez la seringue pour dessiner un rectangle d’un par deux centimètres au milieu d’une diapositive, et utilisez une deuxième pointe de pipette modifiée de 200 microlitres pour placer des organoïdes dégagés au milieu du rectangle. Pour placer un glissement de couverture sur les organoïdes, placez d’abord le côté gauche du couvercle, avant d’abaisser lentement le glissement du couvercle de gauche à droite jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’air emprisonné. Ensuite, appliquez doucement une pression sur tous les bords du glissement du couvercle pour l’attacher fermement au scellant en silicone.
Pour imager les organoïdes, placez la diapositive sur la scène d’un microscope à balayage laser confocal et sélectionnez un objectif multi-immersion 25 X pour l’imagerie confocale. Réglez le microscope aux paramètres d’acquisition appropriés, en sélectionnant une faible puissance laser pour réduire le blanchiment des photos. Utilisez le mode pile Z pour définir les limites supérieures de l’extrémité inférieure et réglez la taille de l’étape Z pour qu’elle soit optimale.
Lors de l’imagerie de grandes structures organoïdes, ou plusieurs organoïdes ensemble, utilisez le mode carrelage avec un chevauchement de 10% et indiquez la zone d’intérêt. Lorsque tous les paramètres ont été définis, obtenez une représentation 3D rendue de l’imagerie dans le logiciel d’imagerie, et optimisez la luminosité, le contraste et les propriétés de rendu 3D. Exportez ensuite des instantanés RVB des résultats sous forme de fichiers TIFF.
La force de l’imagerie 3D par rapport à l’imagerie 2D est illustrée par ces images d’organoïdes de glande mammaire de souris qui ont été générés comme démontré. La couche centrale de ces organoïdes représentatifs se compose de cellules luminaires positives K8/K18 en forme de colonne, et la couche externe contient des cellules de basilic positives K5 allongées, récapitulant la morphologie de la glande mammaire in vivo. Cette organisation polarisée est difficile à apprécier à partir d’une section optique 2D du même organoïde.
Un autre exemple d’une structure complexe qui est impossible à interpréter sans information 3D est le réseau de CANALICULI positif MRP2 qui facilitent la collecte du liquide biliaire des organoïdes hépatiques humains. De plus, la qualité et la résolution obtenues permettent une segmentation semi-automatisée et une analyse d’image. Ainsi, le nombre total de cellules et la présence de marqueurs peuvent être quantifiés dans des sous-types cellulaires spécifiques dans des organoïdes entiers.
En segmentant les noyaux d’un organoïde entier contenant 140 cellules, trois cellules qui affichent une forte positivité pour le marqueur du cycle cellulaire Ki67 peuvent être identifiées. L’agent de compensation optique, FUnGI, surpasse la compensation peu claire et fructose-glycérol dans la qualité du signal fluorescent profondément dans un organoïde. Avec des organoïdes effacés de FUnGI démontrant une intensité globale accrue de fluorescence comparée aux organoïdes peu clairs.
Notez que les restes de BME dans l’échantillon peuvent entraîner une réduction de la pénétration des anticorps et peuvent conduire à un signal de fond élevé. En outre, les organoïdes cystiques ne devraient pas être effacés optiquement s’ils s’effondrent. Avec de légères adaptations au protocole, les échantillons peuvent être utilisés avec une microscopie confoccale super résolution, multi photon et feuille de lumière.
