Soutenu en partie par R01NS064593 et ​​R21ES016636 (KV). Microscopie a été réalisée à l&#39;engagement - Département de Neurobiologie de microscopie &amp; anatomie, pris en charge, en partie, grâce au financement du NIH-NINDS Centre cœur 5P30NS047463 subvention. Le microscope confocal à disque rotatif a été acheté avec un prix NIH-NCRR (1S10RR027957).

Préparation des cellules A. <ol><li> Humaines normales (fibroblastes primaires GM02270) ont été obtenus à partir du référentiel cellulaire Coriell, Camden, New Jersey, et a immortalisé avec hTERT 6. Les cellules ont été cultivées et développées dans CELLSTAR de 6 cm plats dans les médias (4 ml) constitués de MEM supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (Gibco), non-essential/essential acides aminés, de vitamines, de pyruvate de sodium, et de la pénicilline / streptomycine (HyClone ). </li><li> De rein embryonnaire humain 293 (HEK293), les cellules ont été obtenues à partir de l&#39;American Type Culture Collection et pris de l&#39;ampleur en CELLSTAR 6-vaisselle cm. Les cellules ont été maintenues dans les médias (4 ml) constitué de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, non-acides aminés essentiels, de L-glutamine et de la pénicilline / streptomycine. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plasmide 19836) et H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene 17735 plasmide) gène de fusion constructions exprimant également la puromycine ou des gènes de résistance au G418, respectivement, ont été transduites (fibroblam) ou transfectées (HEK293) en utilisant SuperFect (Qiagene) dans les cellules et maintenu sous la sélection des médicaments. Entretien de la fluorescence a été vérifiée périodiquement. </li><li> 24-48 heures avant l&#39;acquisition des images, les cellules ont été traitées à la trypsine dans une suspension à cellule unique et ensemencées à faible densité de 3,5 cm sur FluroDish plaques à fond de verre. </li></ol> Configuration Microscope B. et d&#39;acquisition d&#39;images Ce protocole a été développé en utilisant la cellule Zeiss Observer SD microscope confocal à disque rotatif équipé d&#39;un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-X1A modèle 5000 disque de rotation, 2 Photometrics QuantEM 512SC caméras EMCCD, un HXP 120C à base de fibres d&#39;éclairage, 4 lasers (un Lasos 100mW multi-lignes argon [458, 488, 514 nm], 50 mW nm diode 405, 40 mW nm diode 561, et 30 mW diode 635 nm), AOTF, un Pecon XL multiS1 système d&#39;incubation stade, l&#39;incubation Zeiss modules (Module O 2 S, CO 2 Module S, S TempModule, chauffage Unité XL S) et un pré motorized XY avec un insert NanoScanZ piézo Z. Pour minimiser les aberrations sphériques tandis que les cellules vivantes d&#39;imagerie supporté dans un milieu aqueux, un C-Apochromat 63x/1.20 eau / Corr lentille d&#39;objectif et Zeiss Immersol fluide d&#39;immersion W (avec un indice de réfraction n = 1,334) ont été utilisés. Pour 2 canaux imagerie confocale, une RQFT 405/488/568/647 miroir dichroïque et BP525/50 (vert) et BP629/62 (rouge) filtres d&#39;émission ont été utilisés. Le logiciel du système utilisé était Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) avec AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, physiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, double caméra, l&#39;intérieur de 4D, autofocus et modules Déconvolution 3-D. <ol><li> Veiller à ce que le gaz CO 2 est en marche pour le CO 2 Module du système d&#39;incubation. Si le microscope est supporté par une table anti-vibration de l&#39;air, allumer l&#39;alimentation en air (ou gaz N 2) de la table d&#39;air. </li><li> Tournez sur la puissance du statif du microscope, unité de disque en rotation, caméras, modules d&#39;incubation, illuminateur HXP, platine motorisée, Argonlaser, et l&#39;ordinateur. </li><li> Après 1 min de temps de préchauffage, tournez la clé de contact pour le laser Argon sur &quot;On&quot;. </li><li> Sur le panneau de commande du laser Zeiss, mettez les commutateurs pour les lignes laser à utiliser. </li><li> Mettez le commutateur à bascule pour le contrôleur Lasos laser argon de «veille» à «run laser&quot; et régler le contrôleur de lumière au niveau optimal (c&#39;est à dire juste en dessous du point où le voyant vert s&#39;allume en rouge). </li><li> Démarrez le logiciel AxioVision. Remarque: l&#39;interface utilisateur pour AxioVision peut être personnalisé avec des menus et fenêtres déroulant qui sont spécifiques pour le microscope particulier et les composants qu&#39;il contrôle. Ainsi, chaque système possède une interface potentiellement unique. Par conséquent, des instructions générales pour la manipulation des logiciels sont fournis dans les étapes suivantes, plutôt que de directions pour les fenêtres, les onglets de logiciels spécifiques et / ou des menus déroulants. </li><li> Environ 1 heure avant l&#39;imagerie, dans le logiciel, repérez les contrôles de l&#39;incubateur etallumer le chauffage de la chambre supérieure et la plaque de platine. Réglez la température à 37 ° C. Allumez le CO 2 de contrôle et de régler le niveau à 5%. </li><li> Sélectionner la lentille d&#39;objectif pour l&#39;imagerie. Dans cette étude, une 63x/1.20 NA C-Apochromat Eau / Corr objectif a été utilisé. Remarque: Pour cet objectif, un milieu d&#39;immersion avec un indice de réfraction similaire à l&#39;eau (Zeiss Immersol liquide d&#39;immersion W) est nécessaire. </li><li> Si plusieurs positions distinctes doivent être échantillonnées sur une longue période de temps, être certain d&#39;appliquer une quantité suffisante de milieu d&#39;immersion afin de s&#39;assurer qu&#39;il est réalisé à partir d&#39;une position à une autre. </li><li> Placer la capsule sur la scène et mettre en place la lentille d&#39;objectif en contact avec le fond. </li><li> À l&#39;aide des commandes du microscope ou du logiciel, diriger la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le champ large du filtre définie pour le signal de fluorescence d&#39;intérêt (pour cette étude, &quot;rouge&quot; filtre définie pour 53BP1 et un &quot;GFP&quot; filtre définie pour H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Voir à travers les lentilles oculaires, focaliser l&#39;image, et localiser un champ approprié de cellules. </li><li> En utilisant soit le logiciel ou les commandes de microscope, diriger la lumière émise à l&#39;écart des oculaires vers le port avec l&#39;unité de disque en rotation confocale. </li><li> Dans le logiciel, mettez le laser approprié (pour cette étude, le laser 561 nm pour 53BP1 et la ligne de 488 nm du laser Argon pour H2B). </li><li> Pour chaque canal, régler l&#39;intensité du laser en réglant le filtre acousto-optique accordable (AOTF) de commande à un niveau approprié. </li><li> Sélectionnez le miroir dichroïque appropriée (RQFT 405/488/568/647) et filtres d&#39;émission (BP 629/62 pour 53BP1 et BP 525/50 pour H2B). Ouvrir l&#39;obturateur de l&#39;unité de disque en rotation. </li><li> Sélectionnez la page &quot;Live&quot; fenêtre pour afficher le champ de vue actuel. </li><li> Dans le logiciel, ouvrez le &quot;Camera&quot; de commande, sélectionnez la caméra à utiliser (si un système de double caméra) et régler le temps d&#39;exposition d&#39;environ 100 ms. Régler le% EM et acquérir le necRemarque saire:. La construction 53BP1-mCherry semble un peu faible. Nous avons trouvé utile d&#39;augmenter le gain EM. </li><li> Dans le logiciel, ouvrir la commande de l&#39;unité de disque en rotation confocale et régler la vitesse de rotation du disque en saisissant le temps d&#39;exposition caméra qui a été fixé pour capturer une image convenable (par exemple ~ 100 ms). Cliquez sur &quot;Set&quot; pour verrouiller le changement. </li><li> Ouvrez &quot;multi-dimensionnelle d&#39;acquisition». Sélectionnez l&#39;onglet canal et de charger / sélectionner les canaux appropriés. Pour cette étude, nous utilisons les canaux définis pour dsRED (561 nm et une excitation laser BP 629/62 pour filtre d&#39;émission) et la GFP (488 nm ligne laser pour l&#39;excitation et BP525/50 filtre pour l&#39;émission). </li><li> Pour assurer l&#39;enregistrement d&#39;image, un miroir dichroïque commune (RQFT 405/488/568/647) a été utilisé pour les deux canaux. Réglez le logiciel à la section «Autofocus». Remarque: Allez dans Outils → Paramètres rédacteur en chef pour ajuster les paramètres MDA. Assurez-vous que la puissance du laser est suffisante («la puissance du laser adéquate» fait référence à un paramètre qui vous permetpour exciter le fluorophore approprié tout en minimisant les photo-blanchiment). </li><li> Dans la fenêtre MDA, sélectionnez l&#39;onglet z-pile. Sélectionnez &quot;Z-stack à la position focus courant&quot;. Définissez la plage d&#39;environ 10 um Z-stack et choisissez &quot;optimale&quot; pour le nombre de mesures pour s&#39;assurer d&#39;échantillonnage de Nyquist par Z. Remarque: La taille exacte de la z-pile dépendra de la hauteur de vos cellules. Ajustez en conséquence. </li><li> 23. Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; et d&#39;analyser le résultat z-pile d&#39;images pour s&#39;assurer que les réglages sont appropriés pour ce que vous étudiez (par exemple, dans cette étude, il était important de l&#39;image du noyau entier). </li><li> Sélectionnez le &quot;T&quot; (temps) onglet. Pour notre expérience avec la camptothécine, nous avons mis l&#39;intervalle entre les points de temps d&#39;imagerie à 5 min et la durée totale de la session pendant 1 heure pour un contrôle (cellules non traitées) vidéo. Remarque: afin de minimiser photo-blanchiment des cellules, l&#39;expérience doit être configuré de sorte que l&#39;AOTF flans le laser entre des instants d&#39;imagerie. </li><li> Faou multi-point imagerie de plusieurs cellules dans le plat, dans la fenêtre MDA, sélectionnez l&#39;onglet position. Veiller à &quot;Appliquer&quot; réglage avant / après le point de temps la position par &quot;est cochée. Sélectionnez &quot;Mark_Find&quot;. En utilisant le &quot;Live&quot; point de vue, déplacer la parabole et de sélectionner les champs appropriés de vue. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot; dans le menu multi-dimensionnelle d&#39;acquisition pour commencer l&#39;expérience et enregistrer une vidéo de contrôle (des cellules non traitées). </li><li> Après la vidéo de contrôle, ajoutez le traitement approprié (dans ce cas, 10 camptothécine uM). Nous avons enregistré l&#39;expérimental (cellules traités avec le médicament) vidéo à intervalles 5-10 min pendant 2-4 heures. Remarque: Une question importante à considérer est la rapidité avec laquelle se produit un effet donné après le traitement. Comme on le voit dans la vidéo, 53BP1 foyers commencent à partir de ~ 5 minutes après l&#39;addition du CPT. Même si un processus relativement simple, l&#39;ajout de médicaments à l&#39;antenne manuellement et re-calibrer le microscope prend du temps. Il faut tenir compte lors de la conception de cette expérience. </li><li> Pour la surveillance des mitosis, nous avons mis l&#39;intervalle de 7,5 min et enregistré pendant 4-5 heures (les paramètres spécifiques dépendent de la lignée cellulaire utilisée et la durée de son cycle cellulaire). Ajustements pourraient devoir être prises pour éviter la photo-blanchiment au cours de longs enregistrements. </li></ol> C. Traitement de l&#39;image et de l&#39;analyse Ce protocole a été développé à l&#39;aide du logiciel Volocity (PerkinElmer). Le logiciel utilisé pour l&#39;acquisition de ces données (AxioVision) a également la capacité de traiter et d&#39;analyser les images. Les utilisateurs sont encouragés à utiliser le logiciel mis à leur disposition, et consulter la documentation appropriée concernant leur application. <ol><li> Ouvrez le logiciel Volocity. Créer et nommer une nouvelle bibliothèque, et d&#39;importer vos fichiers vidéo. </li><li> Pour visualiser les fichiers, nous trouvons généralement le plus utile d&#39;utiliser le &quot;Focus étendue&quot; réglage. Cette superpose les tranches z-stack et, par ce protocole, nous permet de visualiser les foyers 53BP1 dans les différents domaines du noyau. </li><li> Ajuster les vidéos selon les besoins. Volocity est équipé d&#39;une gamme d&#39;outils pour améliorer la qualité des images acquises. En s&#39;assurant que les paramètres du microscope étaient appropriées, beaucoup de temps peut être sauvé dans l&#39;édition tard. Souvent, il est utile de déconvolution vos images et ajuster la luminosité / contraste. Vos besoins d&#39;édition spécifiques varieront en fonction de l&#39;expérience. </li><li> Ajouter un horodatage relatif et barre d&#39;échelle. </li><li> Pour afficher les cellules en 3-D, passez au «3-D Opacité&quot; réglage. Cela permet la rotation des cellules 3-D rendus dans l&#39;espace, offrant ainsi des perspectives multiples de structures d&#39;intérêt dans les cellules. Remarque: Il est utile de visualiser les cellules dans des plans différents pour déterminer où les structures de voyage intérêt. Par exemple, dans le &quot;Focus étendue&quot; réglage, il est difficile de discerner que le 53BP1 ne, en effet, dissocier de l&#39;ADN pendant la mitose. Toutefois, cela est évident en 3-D. </li><li> Les films et les images fixes peuvent être exportées dans une variété de types de fichiers en fonction des préférences de l&#39;utilisateur. </l<html> i&gt; </ol> D. Représentant Résultats Un exemple de 53BP1 foyers en réponse au CPT est illustré à la figure 1. Des cellules exposées à l&#39;intérieur des foyers CPT forme 5-10 min, et de maintenir ces foyers pendant toute la durée de l&#39;enregistrement. Comme le montre la figure 2, 53BP1 dissocie de la chromatine au début de la mitose, la formation d&#39;une fine brume autour des chromosomes condensation. En télophase et la mitose se produit arrive à son terme, une fois de plus 53BP1 agrégats dans les foyers distincts. Alors que les cellules HEK293 n&#39;ont pas été exposés au CPT, ils ont néanmoins formé en abondance, des foyers de réparation spontanée générée par 53BP1 dommages à l&#39;ADN endogène. Cette observation nous a permis de conclure que 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose précoce, en accord avec un précédent rapport montrant un effet similaire après l&#39;exposition des cellules aux radiations ionisantes et les drogues radiomimétiques 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Camptothécine (10 pM) provoque CDB et 53BP1 formation de foyers dans le cyclisme fibroblastes dans les 30 minutes de l&#39;ajout de la drogue dans le milieu. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figure 2. 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose jusqu&#39;à telophase/G1 dans les cellules HEK293.

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Maintien de l&#39;intégrité génomique est essentielle à la survie cellulaire. Le défaut de préserver les résultats du génome dans le vieillissement prématuré, la carcinogenèse, ou la mort 8. Il ya un intérêt intense pour discerner comment les fonctions de DDR, découlant de son importance à la recherche fondamentale et clinique. De nombreuses techniques ont été développées au fil des ans afin d&#39;aider à l&#39;étude de la façon dont les cellules détecter et réparer les dommages à l&#...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produit </td><td> Entreprise </td></tr><tr><td> Des boîtes de culture CELLSTAR </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish plats à fond de verre </td><td> Mondiale Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM médias </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Les acides aminés </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamines </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmide </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 plasmide </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss cellulaire Observer SD Système d&#39;imagerie </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (version 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity logiciel (version 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Des cassures double brin (CDB) de l&#39;ADN sont les plus délétères des lésions d&#39;une cellule peut rencontrer. Si laissé non réparés, CSD port un grand potentiel pour générer des mutations et des aberrations chromosomiques 1. Pour éviter ce traumatisme de catalyser l&#39;instabilité génomique, il est crucial pour les cellules pour détecter les conseils scolaires de district, activer la réponse dommages à l&#39;ADN (DDR), et réparer l&#39;ADN. Quand ils sont stimulés, la DDR travaille à préserver l&#39;intégrité du génome en déclenchant l&#39;arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation doit avoir lieu ou forcer la cellule à l&#39;apoptose. Les mécanismes prédominants de réparation des CDB se produire par recombinaison non homologue bout de jonction (NHEJ) et la réparation recombinaison homologue (HRR) (révisé en 2). Il existe de nombreuses protéines dont les activités doivent être précisément orchestrée pour le DDR pour fonctionner correctement. Nous décrivons ici une méthode pour le 2 - et 3-dimensions (D) Visualisation d&#39;une de ces protéines, 53BP1. La protéine p53 lie 1 (53BP1) se localise dans les zones deCDB en se liant aux histones modifiées 3,4, formant des foyers à 5-15 minutes 5. Les modifications des histones et de recrutement de protéines DDR 53BP1 et d&#39;autres vers des sites ORD sont censés faciliter le réarrangement structural de la chromatine autour des zones de dommages et contribuent à 6 réparation de l&#39;ADN. Au-delà de la participation directe à la réparation, des rôles supplémentaires ont été décrits pour 53BP1 dans le DDR, tels que la régulation de un point de contrôle intra-S, un point de contrôle G2 / M, et l&#39;activation de protéines en aval de DDR 7-9. Récemment, on a découvert que 53BP1 ne pas former des foyers en réponse à dommages à l&#39;ADN induits lors de la mitose, au lieu d&#39;attendre pour les cellules à entrer G1 avant de repérer à proximité du CSD 6. DDR protéines telles que 53BP1 ont été trouvés à associer avec des structures mitotiques (comme kinétochores) au cours de la progression à travers la mitose 10. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de 2 - et 3-D imagerie des cellules vivantes pour visualiserla formation de foyers 53BP1 en réponse à l&#39;agent de détérioration d&#39;ADN camptothécine (CPT), ainsi que le comportement de 53BP1 lors de la mitose. La camptothécine est un inhibiteur de topoisomérase I qui provoque principalement CDB lors de la réplication d&#39;ADN. Pour ce faire, nous avons utilisé un décrit précédemment 53BP1-mCherry protéine de fusion fluorescente construire composée d&#39;un domaine protéique 53BP1 capable de se lier CDB 11. En outre, nous avons utilisé une histone H2B-GFP protéine de fusion fluorescente construire en mesure de suivre la dynamique de la chromatine au long du cycle cellulaire, mais en particulier lors de la mitose 12. Imagerie des cellules vivantes dans des dimensions multiples est un excellent outil pour approfondir notre compréhension de la fonction des protéines de DDR dans les cellules eucaryotes.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l&#39;ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

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Biology

14.0K vues.  Virginia Commonwealth University. Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Vidéo: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Recherche

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imagerie par cellules vivantes de l’activité transcriptionnelle lors de ruptures double brin d’ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...