En utilisant ce protocole, la migration cellulaire et l’invasion peuvent être dévoilées dans des conditions en temps réel permettant de déterminer la cinétique cellulaire sous perte ou gain de fonction génétique et de médicaments. Contrairement à d’autres méthodes, aucune coloration, dommages cellulaires mécaniques, ou marqueurs fluorescents nécessaires. Plus important encore, la cinétique cellulaire en temps réel peut être déterminée d’une manière efficace.
Lorsque la culture de la lignée cellulaire U-118MG atteint 70 à 80% de confluence, laver les cellules avec PBS avant de traiter les cellules avec deux millilitres de 0,5% trypsine-EDTA. Après 30 secondes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de culture frais et transférer les cellules détachées à un tube conique de 15 millilitres. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre la pastille dans un six fois 10 à la cinquième cellule par concentration de condition dans le volume approprié de milieu frais.
Transférer six fois 10 à la cinquième cellule dans un tube de microcentrifugeuse par condition et ajouter 800 microlitres de PBS de Dulbecco à chaque tube. Après centrifugation, resuspendez chaque granulé dans 60 microlitres de r tampon de resuspension et six micromolaires du siRNA d’intérêt. Mélanger chaque tube avec un taraudage doux avant d’électroporer 10 aliquots microlitres de chaque suspension cellulaire avec trois impulsions de 10 millisecondes 1, 350 volts.
Après chaque traitement, mettre en commun les cellules électroporées de chaque condition dans des aliquots individuels de cinq millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, ensemencer les cellules en deux plats de culture de 35 millimètres par condition et placer les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Cinq à six heures avant l’analyse cellulaire en temps réel, placez le système d’analyse cellulaire en temps réel dans l’incubateur de culture cellulaire.
Pour mettre en place un test d’invasion, utilisez le pipetage inversé pour placer 50 microlitres de DMEM complétés par 0,1 microgramme par millilitre de gel matriciel extracellulaire dans chaque puits de la chambre haute d’une plaque d’invasion cellulaire. Immédiatement après le placage, retirez 30 microlitres de la solution de matrice extracellulaire de chaque puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Pour mettre en place un programme de mesure de l’impédance, six heures avant la mesure, remplacez le milieu dans toutes les cultures cellulaires électroporées par un milieu sérique faible.
Sous l’onglet Mise en page dans le logiciel de mesure d’impédance associé, sélectionnez des puits quadruplicate pour chaque condition biologique. Sous l’onglet Annexe, définissez une étape unique de balayage de mesure de base avec un intervalle d’une minute et définissez une deuxième étape pour mesurer l’impedance cellulaire dans les berceaux individuels respectifs pour l’expérience proprement dite. Une heure avant le début de la mesure de l’impédance cellulaire, ajouter 160 microlitres de milieu complétés par 10% de sérum bovin fœtal comme chimioattractant dans les puits de la chambre inférieure de la plaque d’invasion cellulaire et de migration.
Pour mesurer l’invasion, assemblez la chambre haute contenant les puits enduits de gel matriciel extracellulaire. Pour mesurer la migration, utilisez des puits non encoated dans la chambre haute. Pour l’un ou l’autre type d’expérience, remplissez les puits de la chambre haute de 50 microlitres de milieu sérique faible et placez les chambres dans le berceau du système.
Cliquez sur l’onglet Message dans le logiciel pour déterminer si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle. Si le message s’affiche comme prévu, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience. Ensuite, placez les plaques complètement emballées dans l’incubateur de culture cellulaire dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel pendant une heure pour acclimater la plaque aux conditions de culture cellulaire.
Pendant que les plaques équilibrent, récoltez les cellules de glioblastome comme démontré et résuspendez les cellules de chaque condition à huit fois 10 à la cinquième cellule par 800 microlitres de faible concentration moyenne de sérum. En outre, réserver trois fois 10 à la cinquième cellule en deux millilitres de milieu de culture pour l’ensemencement dans un plat de 35 millimètres pour l’analyse des taches occidentales en aval. Pour mesurer la lecture de base avant la migration, à la fin de l’acclimatation, cliquez sur le bouton Démarrer du berceau.
Une fois la mesure de base acquise, transférez les plaques de migration et d’invasion de leurs berceaux respectifs dans un cabinet de biosécurité. Pipette inverse 100 microlitres de cellules dans les puits de chambre supérieure quadruplicate pour chaque condition biologique dans le puits approprié des plaques d’invasion et de migration cellulaires tel que programmé dans l’unité de contrôle du berceau. Après l’ensemencement, conserver les plaques dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément sur le fond de la plaque avant de transférer les plaques à leurs berceaux respectifs.
Cliquez sur le bouton démarrer du berceau pour commencer à mesurer l’impédance cellulaire. Pour visualiser les changements dans l’impedance cellulaire en tant qu’index cellulaire d’une manière dépendante du temps pendant ou après la fin de l’expérience, ouvrez l’onglet Analyse de données. Pour visualiser les données pour chacune des conditions respectives individuellement ou en moyenne et/ou en écarts types, cliquez sur les boîtes d’options pour obtenir un écart moyen et type.
Pour exporter les données de l’index cellulaire vers un fichier de feuille de calcul, placez le curseur au milieu de la fenêtre d’analyse des données et cliquez à droite. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, sélectionnez les données de copie dans l’option format liste et coller les données dans une feuille de calcul ouverte. Pour libérer l’expérience, cliquez sur le bouton Libération dans chaque berceau.
Crk adaptateur protéine knockdown diminue les niveaux de protéines Crk1 et Crk2 de 85% et 86%, respectivement, sans induire des niveaux de protéines crk-like. Le knockdown de Crk-like réduit l’expression de protéine crk-like de 85%avec de légères réductions des niveaux de protéine de Crk1 et de Crk2. La combinaison des deux siRNAs réduit l’expression crk1, crk2 et crk-like de plus de 80%, tandis que ni vinculin ni expression alpha-tubulin n’est affectée par n’importe quelle combinaison de Crk ou Crk-like knockdown.
Les cellules du glioblastome cérébral humain migrent le long d’un gradient en réponse à des concentrations élevées de sérum atteignant le niveau maximum de migration à 13 heures. Dans les cellules knockdown Crk, bien que la migration soit initialement retardée, les cellules ont continué à migrer jusqu’à 23 heures. Crk-like knockdown réduit considérablement la migration cellulaire avec la lignée cellulaire du glioblastome complètement perdre leur capacité migratoire à la fois crk et crk-like suggérant que Crk et Crk-like jouent des rôles essentiels chevauchement dans la migration des cellules cancéreuses.
Cependant, lorsque l’invasion cellulaire est surveillée sur plusieurs jours, les cellules knockdown Crk atteindre un niveau maximum similaire d’invasion cellulaire par rapport aux cellules de contrôle du glioblastome à 60 heures avec crk-like cellules partiellement récupérer leur capacité invasive de 90 heures et double cellules Crk-Crk démontrant une capacité réduite d’envahir après 40 heures. Les résultats appuient clairement la suggestion selon laquelle l’invasion cellulaire devrait être analysée pendant toute la durée de l’expérience. L’ensemencement du bon nombre de cellules et l’éviter les bulles d’air tout en enregistrant la matrice extracellulaire pour l’essai d’invasion et les cellules d’ensemencement sont des points clés pour le succès de cette expérience.
Suivant la procédure semblable mais utilisant des e-plaques, l’adhérence cellulaire et la cinétique de prolifération cellulaire peuvent être déterminées.
