Notre protocole est compatible avec d’autres méthodes d’analyse moléculaire et permet d’évaluer comment les médicaments affectent la viabilité des tranches de tissu en tact et la performance du criblage à débit moyen. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons mesurer la viabilité d’une tranche de tissu entier en temps réel avec très peu de pré-ou post-traitement. Cette technique accélère le développement de médicaments précliniques et l’oncologie en testant les candidats médicaments ou les tranches de tissus acquises directement à partir d’échantillons de tissus tumoraux patients.
Notre méthode d’évaluation de la viabilité des tissus en temps réel est très polyvalente et peut être appliquée aux études de biologie du cancer, de neurosciences et de biologie du développement. La préparation de tranches de tissu viables en tact est la clé du succès de la procédure. Les réglages vibratomes en composition moyenne doivent être ajustés en fonction du type de tissu et de la fermeté.
Le jour de l’acquisition de la tranche de tissu tumoral, aliquot 250 microlitres de tissu tranchent le milieu de culture par puits dans une plaque de puits 24 et placent un insert de culture tissulaire dans chaque puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à utilisation. Pour acquérir des fragments de tissu tumoral, submergez le tissu tumoral dans le HBSS glacé dans une plaque de culture de 10 centimètres et utilisez un scalpel pour couper le tissu en deux.
Utilisez un poinçon de biopsie de six millimètres pour acquérir des cylindres du tissu tumoral et couper une extrémité de chaque cylindre pour créer une surface plane. Placez les morceaux de tissu dans le HBSS frais et glacé et allumez un vibratome. Désinfectez tout l’équipement avec soixante-dix pour cent d’éthanol et placez le plateau tampon Vibratome, recouvert d’un couvercle en verre acrylique, au centre du bain de glace Vibratome.
Ajouter de la glace au bain, remplir le plateau tampon avec du HBSS froid. Chargez une lame de rasoir dans le porte-lame et utilisez des forceps à dents pour sélectionner soigneusement un échantillon de tumeur poinçonnée biopsie. Ajouter une goutte de colle cyanoacrylate de qualité médicale sur la plaque du spécimen.
Tamponnez le tissu sur un morceau de serviette en papier sans peluche pour enlever tout tampon excédentaire et monter le cylindre de tissu sur la goutte dans une position stable droite. Après deux à trois minutes de séchage à l’air, placez la plaque dans le bac tampon et ajoutez du HBSS supplémentaire au plateau jusqu’à ce que le tissu soit complètement immergé dans le tampon. Assemblez ensuite le Vibratome en plaçant le plateau de glace et l’assemblage du plateau tampon sur le Vibratome et en verrouilleant le bras.
Réglez l’épaisseur de coupe vibratome à 250 micromètres, l’amplitude à trois millimètres, la vitesse de découpage à 0,01 à 0,25 millimètre par seconde, et l’angle de la lame à 15 à 21 degrés. Réglez les emplacements de départ et d’extrémité de la lame et ajustez la hauteur de la scène. Exécutez l’instrument en mode continu pour couper les tranches pendant plusieurs cycles jusqu’à ce que les tissus soient coupés uniformément.
Utilisez un bipède de transfert de pointe large pour transférer les tranches et une petite quantité de HBSS dans des inserts individuels de culture cellulaire dans chaque puits de la plaque de puits 24 précédemment préparée et utilisez un bipède de transfert de pointe fine pour enlever tout tampon excédentaire des puits. Lorsque la fin de l’échantillon a été atteinte, montez un nouveau morceau de tissu et obtenez des tranches supplémentaires jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment d’échantillons. Ensuite, la culture des tranches de tissu dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 48 heures.
Pour mesurer la viabilité des tranches de tissu, préparez un reagent de mesure de viabilité basé sur la luminescence contenant à la fois la luciferase et la prosubstrate à une à mille dilutions dans le milieu de culture des tranches de tissu frais selon les instructions du fabricant et remplacez le milieu dans chaque puits de la plaque de puits 24 par le mélange. Ajouter 50 microlitres de mélange de substrat enzymatique sur chaque tranche de tissu et placer la plaque sur un shaker orbital à l’intérieur d’un incubateur humidifié avec une agitation douce à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez le signal de luminescence dans chaque puits sur un lecteur de microplaque à l’aide des réglages appropriés.
Après avoir déterminé la viabilité de base des tranches de tissu, dissoudre les médicaments d’intérêt dans le milieu de culture des tranches de tissu pour obtenir des solutions de stock 10x et ajouter chaque solution médicamenteux 10x au milieu de la culture au fond de chaque tranche de tissu bien. Transférez 50 microlitres du milieu complété par le médicament du fond de chaque puits sur chaque tranche de tissu et retournez les tranches au shaker orbital pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez la plaque de culture à l’incubateur de sous-culture sans trembler et mesurez l’intensité luminescente de chaque échantillon de tissu sur le lecteur de microplaque aux points de temps expérimentaux appropriés.
La viabilité des tissus tumoraux traités à chaque point de temps peut ensuite être calculée à l’aide de l’équation comme indiqué. La viabilité des tranches de tissu préparées à partir d’un échantillon de tumeur de cancer du sein de souris peut être maintenue pendant au moins 21 jours avec des échanges moyens occasionnels. Le traitement avec l’inhibiteur de la multikinase pendant quatre jours réduit l’intensité du signal de luminescence de 100 fois par rapport aux tissus tumoraux de contrôle traités avec du sulfoxyde de diméthyle.
Le traitement avec la moitié de la concentration du même inhibiteur diminue la luminescence dès le premier jour et atteint le niveau le plus bas au quatrième jour, restant bas pour chaque point de temps mesuré suivant. En revanche, l’intensité luminescente du groupe commandé de tissu de tumeur reste stable tout au long de la culture de six jours. En outre, le traitement des tranches de tumeur de cancer du sein de souris avec des doses périodiques de l’inhibiteur pendant quatre jours illustre les changements dose-dépendants dans la viabilité de tranche dans la concentration effective demi-maximale du médicament.
Les xénogreffes dérivées du patient traitées avec de la doxorubicine, un médicament chimiothérapeutique standard, présentent également des changements de viabilité dépendants de la dose. En outre, l’essai de dix-sept médicaments précliniques et cliniquement approuvés dans le triplicate sur des tranches de tissu préparées à partir d’une xénogreffe patient-dérivée simple en vrac fournit la preuve du concept que le criblage moyen de drogue de débit peut être exécuté sur des tranches de tumeur avec le microenvironnement indigène de tumeur. Lors de la préparation des échantillons de tissu tumoral, prendre soin de minimiser le contact avec les tranches de tissu pour éviter d’endommager le tissu.
Notre méthode peut être couplée avec d’autres approches telles que l’IHC, la cytométrie d’écoulement, ou le séquençage d’une seule cellule, pour obtenir l’information spatiale et unicellique des tissus. Notre technique permet de tester les effets de plusieurs médicaments d’intérêt à différentes doses dans des conditions physiologiques au fil du temps. Lors de la préparation des tranches de tissu à partir de tumeurs avec un statut pathogène inconnu, assurez-vous d’effectuer toutes les procédures dans une armoire de biosécurité.
