Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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Les auteurs aimeraient reconnaître que cette recherche a reçu des fonds du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne pour le projet PATROLS, en vertu de l’accord de subvention n° 760813

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les applications pour les modèles hépatiques 3D varient considérablement selon le point de terminaison biochimique particulier ou la voie défavorable de résultats étant visée. Chaque modèle a ses avantages et ses limites, de la variation interdonor dans les modèles primaires d’hépatocyte humain (PHH) à l’activité réduite de cytochrome p450 dans les modèles basés sur la ligne cellulaire, mais tous sont valables dans leur propredroit 6,12,18,19. Lors de l’évaluation de la génotoxicité, il y a des limites dans la compatibilité des modèles avec les critères d’évaluation approuvés par la réglementation tels que l’analyse in vitro du micronucléus, car la prolifération active est nécessaire. Ceci est nécessaire, car l’évaluation de génotoxicité exige la quantification des dommages fixes d’ADN pour être évaluée division de poteau de cellule quand il y a l’occasion pour la réparation d’ADN pour corriger des lésions passagères. Malheureusement, les hépatocytes à base d’hépatocytes hautement différenciés (c.-à-d. les sphéroïdes à base d’HépaRG) ou microtissues PHH, qui sont réputés présenter les caractéristiques hépatiques les plus pertinentes sur le plan physiologique, forment des modèles statiques (non prolifératifs)12,19,20. En conséquence, le modèle sphéroïde 3D HepG2 présenté ici fournit un modèle alternatif approprié capable de soutenir les tests de génotoxicité. Les sphéroïdes à base de lignée cellulaire HepG2 ont suffisamment de cellules de division active sur la surface externe des sphéroïdes tout en conservant des caractéristiques hépatiques de base, telles que la production d’albumine et d’urée et certaines activités CYP4505,12,19. Principalement ce modèle de foie in vitro a été développé pour compléter l’analyse de micronucléus, car c’est l’un des deux essais in vitro recommandés dans la batterie pour l’essai de génotoxicité8,10,11,21. Cependant, le modèle peut être facilement appliqué aux technologies d’analyse du séquençage de l’ADN et d’expression des gènes (ARN), alors qu’il a le potentiel d’être davantage adapté et utilisé pour d’autres critères d’évaluation des dommages à l’ADN, tels que l’analyse de la comète. Néanmoins, il est important de tenir compte du rôle que joue l’interférence ENM dans certaines analyses de points de terminaison. Par exemple, les analyses basées sur la cytométrie de flux peuvent ne pas convenir à l’évaluation de la génotoxicité enM spécifiquement en raison de l’interférence desparticules 22.
Un facteur limitant des modèles sphéroïdes qui subissent activement la division cellulaire est leur taille. L’optimisation de la densité d’ensemencement est essentielle car il doit y avoir suffisamment de cellules qui permettent au modèle de continuer à proliférer; mais pas trop élevé un nombre de cellules, ce qui entraîne le sphéroïde devient trop compact, conduisant à un noyau nécrotique accru. La cause de cette nécrose est considérée comme limitant la diffusion de l’oxygène et des nutriments, car la limite de cette diffusion est considérée comme environ 100 - 150 μm de tissu23,24. Toutefois, cela dépend du type de cellule, du numéro de cellule, des interactions d’échafaudage et des conditions de culture25. Depuis, il a été démontré qu’environ 700 μm de diamètre est la limite pour éviter l’apparition prématurée de la nécrose au centre des sphéroïdes C3A, l’ensemencement de 4000 cellules HepG2 par sphéroïde assure le diamètre du modèle au moment de l’exposition est de ≤500 μm26. En outre, Shah et coll. ont établi que les cellules HepG2 ensemencées au-dessus de 5000 cellules par sphéroïde présentaient une réduction de 25 % de la viabilité après 7 jours de culture, ce qui pourrait se rapporter au diamètre moyen de 680 μm et à la disponibilité limitée des nutriments dans une goutte suspendue de 20 μL5. Pour surmonter cela, le modèle conçu dans le présent protocole subit une étape critique où la goutte suspendue est transférée dans des puits recouverts d’agarose après la formation initiale du sphéroïde. Cela garantit un plus grand volume de milieu de culture est présent pour soutenir le nombre sans cesse croissant de cellules dans les sphéroïdes. En conséquence, le modèle sphéroïde HepG2 reste plus de 70% viable après 10 jours en culture et peut être utilisé pour l’évaluation des risques à long terme in vitro. 
Tandis que le modèle sphéroïde d’HepG2 peut soutenir des régimes aigus et à long terme d’exposition, le milieu rafraîchissant de culture cellulaire pendant des périodes prolongées de culture est limité pour ce modèle car le remplacement complet du milieu n’est pas conseillé en raison de la perte potentielle des sphéroïdes. On présume qu’avec les expositions à l’ENM, la tendance à des dispersions homogènes de l’ENM à l’aggloméate et aux sédiments est élevée. Toutefois, il est à noter que la vitesse à laquelle un ENM sédimente peut varier en fonction des paramètres des particules (p. ex., taille, forme et densité) et peut être déterminée théoriquement à l’aide du modèle de sédimentation, de diffusion et de dosimétrie in vitro (DISD), ou de ses dérivés récents, souvent mentionnés lorsqu’il s’agit de l’exposition à l’ENM (suspension),approche 27,28. Avec ceci est esprit, on suppose que si seulement 50% du milieu de culture cellulaire est soigneusement enlevé de la surface de la culture cellulaire, la perturbation et l’enlèvement ultérieur de la dose d’ENM devraient en théorie être minimes. Toutefois, avec le mouvement brownien en jeu, ce n’est peut-être pas strictement le cas et d’autres travaux de dépôt et de sédimentation de chaque ENM à tester devraient être entrepris pour s’assurer que la dosimétrie correcte est conservée tout au long des régimes d’exposition à long terme27. Il s’agit principalement d’une limitation potentielle à considérer lors de l’exécution de régimes de dosage répétés, car cela pourrait être essentiel à la concentration finale accumulée. Les expositions à base de produits chimiques, d’autre part, bien que non sans leurs propres limites à considérer, offrent une approche plus simpliste en ce que les substances chimiques ont tendance à rester en solution et donc un remplacement direct de la concentration chimique d’origine en plus de la concentration nouvellement ajoutée garantit que tout produit chimique perdu lors du rafraîchissement des médias est remplacéen conséquence 29. Les applications futures comprendraient l’évaluation de l’adéquation du modèle pour les régimes d’exposition répétés sur des périodes de culture à long terme, car les stratégies de dosage répétées sont d’une importance cruciale pour évaluer la capacité d’un système d’organes particulier à améliorer ou à surmonter les effets indésirables, le cas échéant, induits par la bioaccumulation d’une substance xénobiobiotique.
En conclusion, ce modèle hépatique in vitro 3D a la capacité d’être utilisé pour évaluer une gamme de scénarios d’exposition réalistes, offrant ainsi une approche in vitro future pour mieux soutenir l’ENM et l’évaluation des risques chimiques d’une manière routinière et facilement accessible.

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Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

En raison du développement et de la mise en œuvre rapides d’un large éventail de nanomatériaux d’ingénierie (ENM) dans une pléthore d’applications à base humaine (p. ex., alimentation, cosmétiques, vêtements, équipements sportifs, électronique, transport et médecine), il est inévitable que les humains soient exposés régulièrement à l’ENM. Avec cela, on s’inquiète de plus en plus du fait que les caractéristiques physiochimiques nouvelles et spécifiques à la taille qui jugent ces matériaux avantageux dans de nombreuses applications pourraient avoir des effets néfastes sur la santé humaine et l’environnement simultanément. À l’heure actuelle, de nombreuses activités internationales sont en place pour refléter activement des expositions plus pertinentes sur le plan physiologique à ces ENM et évaluer la toxicité potentielle de ces matériaux par rapport aux scénarios d’exposition aiguë, à long terme et répétées à faible dose.
La toxicologie hépatique est essentielle lors de l’examen de l’exposition à l’ENM, car il est largement connu que le foie est un site majeur de l’accumulation ENM aprèsexposition 1,2. En outre, le foie est le système principal d’organe pour le métabolisme et la désintoxication des substances qui entrent dans la circulation systémique3. Sur la base de la compréhension acceptée que les modèles d’hépatocytes 2D n’imitent pas exactement les complexités des interactions multicellulaires complexes ou représentent de manière appropriée l’activité métabolique observée in vivo, un plus grand accent a été mis sur le développement de modèles hépatiques 3D in vitro robustes et physiologiquement pertinents pour les technologies de substitution in vivo aété établi 4,5. L’utilisation de technologies avancées de culture 3D améliore la longévité des modèles hépatiques in vitro, ce qui permet d’étudier des régimes d’exposition répétés à long terme. En outre, ce format de culture avancée favorise la formation de caractéristiques physiologiques et organotypiques améliorées telles que le canaliculi biliaire, les processus de transport actif et l’amélioration des capacités de métabolisation des médicaments CYP450, améliorant ainsi la prévisibilité des modèles6. Les modèles hépatiques 3D actuels, composés de monocultures (hépatocytes seulement) ou de co-cultures (hépatocytes avec cellules non paroenchymales) existent sous plusieurs formats, allant des microtissues ou sphéroïdes dans des plaques d’adhérence ultralow, sphéroïdes suspendus goutte, cellules intégrées dans les matrices et / ou échafaudages et plates-formes de culture cellulaire microfluidique, qui sont tous considérés comme efficaces modèles avancés in vitro pour l’évaluation de la toxicité hépatique6,7. Cependant, la majorité de ces systèmes modèles sont à entretien élevé, nécessitent de l’équipement spécialisé et sont coûteux. En outre, ces modèles sont souvent statiques (c.-à-d. modèles cellulaires non divisés) qui empêchent leur utilisation dans l’évaluation des points de terminaison des dangers, tels que les tests de génotoxicité utilisant des méthodes qui quantifient les dommages fixes à l’ADN. La génotoxité est une condition essentielle à la toxicologie réglementaire, et elle est un élément essentiel de l’évaluation des risques de tout toxicant8. Il n’y a pas de seul essai qui peut être appliqué pour quantifier toutes les formes de dommages à l’ADN qui peuvent survenir après l’exposition à un agent exogène. Cependant, un composant central de la batterie d’essai de génotoxicité in vitro est l’essai de micronucléus, qui est une technique fiable et multifacetted qui mesure les dommages chromosomiques bruts9. Il s’agit d’une technique d’étalon-or décrite par la Ligne directrice 487 de l’OCDE sur les tests, pour évaluer les dommages et la génotoxicité de l’ADN in vitro, et elle fait partie de l’exigence relative à la batterie d’essaipour l’évaluation réglementaire des risques 10,11.
La lignée cellulaire du carcinome hépatocellulaire humain, HepG2, est largement utilisée pour le dépistage initial de l’évaluation des dangers, car les cellules sont facilement disponibles, relativement peu coûteuses à la source, simples à la culture et à un criblage à hautdébit 12,13. Lorsqu’ils sont cultivés dans des structures sphériques 3D, il a été démontré qu’ils récapitulent bien le microenvironnement hépatique et offrent un modèle hépatique avec des capacités prolifératives suffisantes pour soutenir l’analyse de micronucléus3. D’autres développements des modèles sphéroïdes HepG2 ont été mis en place pour améliorer la longévité et la fonctionnalité hépatique du modèle afin de soutenir l’évaluation des risques de génotoxicité sur les régimes d’exposition répétés à long terme (≤14 jours). Ainsi, conformément aux principes des 3R pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale, le protocole actuel a été établi pour fournir un modèle hépatique in vitro avancé en 3D capable d’évaluer de manière fiable de multiples critères toxicologiques (p. ex., fonctionnalité hépatique, marqueurs inflammatoires (pro)inflammatoires, cytotoxicité et génotoxicité) suivant des expositions chimiques aiguës, à long terme et répétées et enm d’une manière routinière et facilement accessible.
Ici, nous présentons une méthode pour établir une lignée physiologiquement pertinente de cellules d’hépatocyte 3D basée le système in vitro de modèle pour l’évaluation de danger de génotoxicité suivant les expositions aiguës ou à long terme, répétées d’ENM. Le protocole peut être décomposé en 6 étapes clés : la culture des cellules hepG2 cryopréservées; Préparation sphéroïde HepG2; Transfert de sphéroïdes HepG2 de la chute suspendue à la suspension agarose; Récolte de sphéroïdes HepG2; analyse et notation de micronucléus ; et l’analyse des données.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

En raison du développement et de la mise en œuvre rapides d’un large éventail de nanomatériaux d’ingénierie (ENM), l’exposition à l’ENM est inévitable et le développement de systèmes de test in vitro robustes et prédictifs est essentiel. La toxicologie hépatique est essentielle lors de l’examen de l’exposition à l’ENM, car le foie joue un rôle vital dans l’homéostasie métabolique et la désintoxication, en plus d’être un site majeur d’accumulation enM après exposition. Sur la base de ceci et de la compréhension acceptée que les modèles d’hépatocyte 2D n’imitent pas exactement les complexités des interactions multicellulaires complexes et de l’activité métabolique observée in vivo, il y a un plus grand accent sur le développement des modèles physiologiquement pertinents de foie 3D adaptés aux buts in vitro d’évaluation de danger d’ENM. Conformément aux principes des 3R pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale, un modèle hépatique à base de lignée cellulaire 3D HepG2 a été développé, qui est un système convivial et rentable qui peut prendre en charge les régimes d’exposition à la FOIS prolongés et répétés en MATIÈRE (≤14 jours). Ces modèles sphéroïdes (≥500 μm de diamètre) conservent leur capacité proliférative (c.-à-d. les modèles cellulaires de division) leur permettant d’être couplés à l’analyse micronucléus « étalon-or » pour évaluer efficacement la génotoxicité in vitro. Leur capacité de rendre compte d’une gamme de critères d’évaluation toxicologiques (p. ex., fonction hépatique, réponse (pro)inflammatoire, cytotoxicité et génotoxicité) a été caractérisée à l’aide de plusieurs ENM dans les régimes d’exposition aigus (24 h) et à long terme (120 h). Ce modèle hépatique in vitro 3D a la capacité d’être utilisé pour évaluer des expositions enM plus réalistes, offrant ainsi une approche in vitro future pour mieux soutenir l’évaluation des risques ENM d’une manière routinière et facilement accessible.

L’adéquation de ce modèle sphéroïde hépatique 3D basé sur la lignée cellulaire pour la culture à long terme et l’évaluation des risques génotoxiques a été évaluée en effectuant une caractérisation de base pour déterminer la viabilité et la fonctionnalité hépatique du modèle sur une durée de 14 jours en culture ainsi que son applicabilité pour l’essai de micronucléus.
Caractérisation de base du modèle sphéroïde hépatique 3D HepG2 Avant toute évaluation toxicologique in vitro, il est important de vérifier que les sphéroïdes 3D HepG2 se sont formés correctement avant d’effectuer le transfert d’agarose ou le traitement chimique/ENM. Les sphéroïdes HepG2 produits selon la méthode de chute suspendue prennent habituellement de 2 à 3 jours après l’ensemencement (4 000 cellules/sphéroïdes) pour former des sphéroïdes compacts en forme de sphérique d’un diamètre moyen de 495,52 μm W x 482,69 μm H, comme le montre la figure 5A-5C. Les sphéroïdes HepG2 qui se sont formés correctement et qui sont acceptables pour l’évaluation toxicologique in vitro doivent avoir une structure compacte en forme sphérique avec une surface lisse et aucune projection visuelle. La figure 5 fournit des exemples de sphéroïdes de bonne qualité (figure 5D-F) et de mauvaise qualité (figure5G-I). Ces derniers devraient être jetés. En règle générale, 90-95% des sphéroïdes formés par plaque se formeront correctement et seront viables pour d’autres expérimentations.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figure 5: Images de microscopie légère montrant la morphologie naturelle des sphéroïdes HepG2 formés par la méthode de la chute suspendue. (A-C) montrent jour 2 et (D-I) Jour 4 HépG2 sphéroïdes hépatiques après l’ensemencement. (D-F) sont des exemples de sphéroïdes HepG2 de bonne qualité tandis que (G-I) montre sphéroïdes mal formés. Toutes les images ont été prises sur un objectif X20 à l’aide d’un microscope. La barre d’échelle représente 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Pour confirmer davantage la viabilité sphéroïde hepG2, un test d’analyse ou d’urea de base de Bromocresol Green Albumin (BCG) peut être effectué pour évaluer leur fonctionnalité hépatique. La fonctionnalité de base du foie a été évaluée en fonction de la viabilité à l’aide de l’essai trypan blue exclusion sur une période de culture de 14 jours afin de déterminer la longévité du modèle sphéroïde hépatique et d’établir si elle pouvait soutenir l’évaluation à long terme ou répétée des risques à base d’ENM/produits chimiques (figure 6). La concentration d’albumine est restée constante pendant toute la durée de la période culturelle. La production d’urée affiche une augmentation de la concentration d’urée produite par sphéroïde sur une semaine en culture avant d’atteindre un plateau au jour 7. Il est important de noter que les niveaux d’albumine et d’urée produits dans les sphéroïdes 3D HepG2 sont sensiblement plus élevés que ceux observés dans la même lignée cellulaire cultivé dans un format 2D. En effet, les cultures 2D des cellules HepG2, des niveaux d’albumine et d’urée de pointe étaient respectivement de 0,001 mg/mL et de 0,010 ng/μL. En outre, dans des travaux antérieurs publiés par Shah et coll. utilisant un système sphéroïde HepG2 presque identique, les auteurs soulignent une amélioration notable de l’activité métabolique (CYP1A1 et CYP1A2) dans les systèmes de modèle in vitro 3D HepG2 par rapport aux cellules hepG22D cultivés 5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figure 6 : Données de caractérisation de base de 14 jours pour les sphéroïdes hépatiques HepG2. Après le transfert de la chute suspendue, (A) met en évidence la viabilité du modèle sphéroïde HepG2 sur une période de 14 jours tandis que (B) et (C) mettre en évidence le foie comme l’albumine et l’urée fonctionnalité respectivement. Données ± SEM présentées, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Avec le développement inévitable d’un noyau nécrotique, une limitation connue des cultures sphéroïdes hépatiques 3D, la viabilité de ce modèle basé sur l’hépatite 2 a dû être établie pour démontrer qu’il était capable de maintenir des régimes d’exposition à long terme (5-10 jours) tout en maintenant la capacité proliférative nécessaire pour soutenir l’essai de micronucléus5. En effet, ce modèle sphéroïde hépatique 3D a été montré pour conserver >70% viabilité sur 10 jours en culture. Sur cette base et en conjonction avec la fonctionnalité soutenue de type foie observée au cours de la période de culture de 14 jours ≥, ce modèle sphéroïde hépatique 3D peut ainsi soutenir à long terme, les régimes répétés d’exposition en MEN jusqu’à 10 jours (c.-à-d., avant que la viabilité des sphéroïdes ne tombe en dessous de 70 %). À titre de référence, il est conseillé que les niveaux d’albumine pour les sphéroïdes HepG2 ensemencés à 4000 cellules/sphéroïdes devraient être ≥20,0 ng/μL tandis que la production d’urée devrait être de ≥0,25 ng/μL avant d’effectuer une évaluation toxicologique in vitro avec ce modèle.
Évaluation de la génotoxicité des nanomatériaux d’ingénierie Pour l’évaluation de génotoxicité, l’essai de micronucléus a été employé pour déterminer la présence des micronucléi suivant des expositions aiguës (24 h) et à long terme (120 h) d’ENM. Aflatoxin B1 est un carcinogène connudu foie 16,17 et est un contrôle positif recommandé pour l’analyse micronucléus. Des expériences d’optimisation ont montré que 0,1 μM d’Alfatoxin B1 induit une réponse génotoxique positive significative (≥ 2,0 fois plus) dans les sphéroïdes hépatiques 3D HepG2 et est donc utilisé dans chaque analyse micronucléaire menée avec ce modèle. Pour assurer la validité des résultats de l’analyse micronucléus à l’aide du modèle sphéroïde HepG2, la fréquence micronucléus de fond pour les cellules HepG2 utilisées dans ce modèle in vitro 3D devrait se situer dans une fourchette de 0,6 % à 1,2 %. En conséquence, Alfatoxin B1 devrait induire une réponse génotoxique d’au moins deux fois plus élevé que celle observée avec le contrôle négatif; ainsi, 0,1 μM d’Alfatoxin B1 devrait induire une fréquence de micronucléi entre 1,5% - 3,0%. À l’aide de ces paramètres de contrôle, la génotoxicité associée à l’ENM in vitro peut ensuite être évaluée de manière fiable. D’après la Ligne directrice 487 de l’OCDE sur les essais, il est important de noter que lors de l’essai d’un ENM ou d’un produit chimique, les concentrations sélectionnées ne devraient pas induire plus de 55 % ± une cytotoxicité de 5 % (indiquée par une réduction des valeurs cpbi ou rvcc par rapport au contrôle négatif)11. La figure 7 illustre les données générées lorsque l’Aflatoxine B1 et deux ENM (dioxyde de titane (TiO2) et ruban (Ag)) ont été évalués à la suite d’expositions aiguës et à long terme dans les sphéroïdes HepG2, et le potentiel génotoxique subséquent a été analysé à l’aide de l’analyse du micronucléus. Les deux ENM évalués ont été testés à une faible dose noncytotoxique de 5,00 μg/mL au cours d’une exposition aiguë (24 h) et d’un régime d’exposition à long terme (120 h). On peut observer une tendance similaire à la génotoxicité chez les ENM TiO2 et Ag, selon laquelle la réponse élevée de génotoxicité qui a résulté après une exposition de 24 h n’était pas évidente après une exposition à long terme de 5 jours. Ceci en dépit de la génotoxicité soutenue induite par le contrôle positif d’Aflatoxin B1 aux deux points de temps.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figure 7 :Évaluation de la génotoxité à la suite de l’exposition de TiO2 et ag ENM sur les sphéroïdes hépatiques HepG2. Évaluation de la génotoxité (fréquence micronucléus) à l’aide du poste d’analyse micronucléus (A) aiguë (24heures)et ( B ) exposition à long terme (120 heures) à 5,00 μg/mL de TiO2 et Ag ENM. Le contrôle négatif est un média seulement, tandis que le contrôle positif est de 0,1 μM d’Aflatoxine B1. Données moyennes (n=2) présentées ± SD. Importance indiquée par rapport au contrôle négatif : * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Cette procédure a été établie pour être utilisée pour développer des cultures hépatiques 3D avancées in vitro, ce qui peut fournir une évaluation plus physiologiquement pertinente des dangers génotoxiques associés aux expositions aux nanomatériaux sur un régime de dose répété aigu ou à long terme.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K vues.  Swansea University Medical School. Cette procédure a été établie pour être utilisée pour développer des cultures hépatiques 3D avancées in vitro, ce qui peut fournir une évaluation plus physiologiquement pertinente des dangers génotoxiques associés aux expositions aux nanomatériaux sur un régime de dose répété aigu ou à long terme.

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

Un modèle biomimétique pour le cancer du foie pour étudier les interactions tumeur-stroma dans un environnement 3D avec tunable propriétés bio-physiques

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bio-ingénierie

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Le diméthylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Modèle chez le rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Médecine

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Double coulée de résine suivie d’une micro-tomodensitométrie pour l’analyse 3D du foie

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

Imagerie 3D de la matrice extracellulaire hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite non alcoolique

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

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