La glomerulonephritis cause des dommages glomerular pathologiques avec la mort cellulaire considérable et la libération extracellulaire d’ADN. Ce protocole permet la visualisation de l’ADN extracellulaire sur le site de libération pendant les lésions pathologiques. L’avantage de cette technique est qu’elle mesure l’ADN extracellulaire de la mort cellulaire dans le rein.
Contrairement au sérum ou à l’urine, la mesure extracellulaire de l’ADN est un marqueur de substitution pour les dommages pathologiques. L’importance de cette méthode est que la coloration extracellulaire d’ADN et l’analyse d’image sont facilement transférables à d’autres maladies autoimmunes telles que la polyarthrite rhumatoïde et le lupus. Cette méthode nécessite une connaissance de base de l’histologie rénale.
Pour permettre la détection précise de l’ADN extracellulaire glomerular, le chercheur doit être en mesure d’identifier correctement glomeruli. Pour la coloration extracellulaire de l’ADN, chauffez d’abord les échantillons d’intérêt dans un support de glissière à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes avant d’immerger les glissières dans deux changements de solvant de 40 minutes dans un capot de fumée. Après la deuxième immersion, réhydrater les échantillons deux fois dans 100% d’éthanol et une fois dans 70% d’éthanol pendant cinq minutes par traitement.
Après le dernier traitement, utiliser des pinces pour placer les toboggans dans la solution d’extraction d’antigène bouillant dans un autocuiseur à feu doux pendant 10 minutes. Après avoir démasqué les épitopes d’antigène, transférer l’autocuiseur de la chaleur dans un évier et faire couler immédiatement l’eau froide du robinet sur le couvercle. Laissez les glissières s’équilibrer pendant 20 minutes dans la solution de récupération de l’antigène avant de laver les échantillons deux fois en 0,01 PBS molaire sur un shaker orbital pendant cinq minutes par lavage.
Après le deuxième lavage, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des échantillons de tissu rénal et bloquer toute coloration non spécifique avec 60 microlitres de sérum de poulet à 10% dans 5% d’albumine de sérum bovin pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, remplacer soigneusement la solution de blocage par 60 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dans une chambre d’humidité pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les glissières d’un shaker orbital en PBS pendant deux minutes par lavage avant d’ajouter 60 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié à chaque glissière pour une incubation de 40 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, laver les glissières dans PBS comme démontré, suivie d’un traitement dans 0,3% de noir du Soudan dans 70% d’éthanol pour étancher toute autofluorescence induite par la formaline potentielle. Après 30 minutes, laver les glissières dans l’eau du robinet pour enlever tout précipité et plonger les glissières dans pbs pendant 10 minutes pour empêcher toute formation de précipité noir du Soudan. À la fin de l’incubation, monter les diapositives sur des couvertures en verre confocal avec trois gouttes de 60 microlitres de solution de montage complétées par DAPI et sceller les coverslips avec du vernis à ongles.
Laissez les glissières guérir pendant 24 heures à température ambiante. Conservez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie par microscopie à balayage laser confocale selon les protocoles standard. Assurez-vous de sceller les coverslips avec du vernis à ongles pour éviter tout mouvement pendant l’imagerie et de nettoyer les couvercles de l’éthanol pour améliorer la résolution d’imagerie.
Après avoir imagerie 20 glomeruli par diapositive, ouvrez le plugin de segmentation Weka dans ImageJ et déposez la première image sur la barre d’outils ImageJ. Cliquez sur l’image, la couleur et les canaux divisés. Une image montrant la coloration primaire d’anticorps apparaîtra.
Pour créer un fichier fusionné des images simples, cliquez sur la couleur et fusionnez les canaux. Une boîte popup apparaîtra demandant qu’une couleur soit attribuée à chaque canal. Vérifiez le créer composite et garder les boîtes d’images source et cliquez sur OK. Une image composite fusionnée apparaîtra.
En utilisant la coloration primaire des anticorps comme guide, dessinez une région d’intérêt autour de la touffe glomerulaire. Pour effectuer un flou gaussien sur l’image DAPI bleue unique, cliquez sur le processus, les filtres et le flou gaussien. Réglez le flou à un à deux.
L’image deviendra un peu floue, mais les noyaux apparaîtront lisses, l’arrière-plan sera adouci. Ensuite, cliquez sur plugins, segmentation, et la segmentation weka trainable, et utilisez l’outil main libre pour tracer les noyaux intacts. Lorsque tous les noyaux d’intérêt ont été ajoutés, ajouter la boîte de classe 1, utiliser l’outil de ligne pour délimité les zones d’arrière-plan à la boîte de classe deux.
Cliquez sur créer une nouvelle classe et utilisez l’outil de ligne pour décrire l’ADN extranucléaire taché de DAPI. Cliquez sur classificateur de train et obtenir la probabilité. Basculer la souris pour obtenir une image en noir et blanc de tous les composants avec l’objet de sélection mis en évidence en blanc.
Pour dupliquer cette image, cliquez sur l’image et dupliquez. Sous l’image, ajuster et seuil. Utilisez le bouton de la souris pour ajuster le seuil jusqu’à ce que seul l’ADN extracellulaire soit observé.
Après le seuil, cliquez sur le processus, binaire, et faire binaire, et copier la région glormerular précédemment généré d’intérêt. Contrôle de presse Shift E pour sélectionner les modifications, sélections et restauration pour restaurer la sélection. Pour mesurer uniquement les particules d’ADN extracellulaires dans le glomerulus, cliquez sur analyser les particules et OK. Une feuille de résultats montrant le nombre de particules, la zone, les pixels moyens et le pourcentage de glomeruli contenant de l’ADN extracellulaire sera générée.
Pour enregistrer le classificateur en tant que classificateur d’ADN extracellulaire, cliquez sur enregistrer classifier et enregistrer les données. Pour réappliquer le modèle aux images ultérieures, répétez le traitement initial de l’image tel qu’il a été démontré avant de sélectionner le classificateur de charge et le fichier classificateur enregistré. Le menu journal apparaîtra et exécutera le modèle.
Une fois que le modèle s’est exécuté, cliquez sur les données de charge et sélectionnez l’extracellulaireDNA.arff. Cliquez ensuite sur créer le résultat. Si l’image résultante n’a pas réussi à capter tous les noyaux, l’arrière-plan ou l’ADN extracellulaire, cliquez sur retrain classifier et ajouter plus de classificateurs si nécessaire.
Ici, des images à canal unique montrant l’ADN représentatif et la coloration bêta-actine sont affichées. La fusion des deux images permet de tirer une région d’intérêt autour de la zone glomerular pour la mesure de l’ADN extracellulaire dans le glomeruli de rein de souris utilisant la segmentation formable de Weka comme démontré. Ce modèle peut être adopté pour identifier l’ADN extracellulaire dans les spécimens de biopsie rénale d’un patient témoin ou la comparaison à celle d’une biopsie rénale d’un patient présentant la vascularite ANCA myeloperoxidase.
En outre, ce programme peut être traduit à d’autres taches dans les échantillons de tissu rénal, par exemple, à la tache pour les pièges extracellulaires neutrophiles et le dépôt de myeloperoxidase extracellulaire dans la vascularite anca-associée. Fait important, aucune différence significative n’est observée lorsque les mêmes données sont analysées par plusieurs utilisateurs. L’étape la plus critique de l’analyse est de fournir suffisamment d’exemples d’arrière-plan, de noyaux et d’ADN extracellulaire avec glomeruli comme classificateurs pour le programme de segmentation Weka à apprendre.
Cette méthode est facilement transférable. Par exemple, une analyse plus poussée des différents types de mort cellulaire peut être étudiée par la coloration d’anticorps spécifiques contre des marqueurs d’apoptose ou de nécrose. Notre technique peut être employée avec d’autres processus inflammatoires tels que l’évaluation de l’expression de TLR dans la maladie rénale autoimmune ou l’expression extracellulaire de myeloperoxidase dans les biopsies humaines de rein.
