Name: pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells at JoVE.com

Les données représentatives ont été financées par l’Institut national du cancer (K22CA218549 à S.T.S). En plus de leur aide dans le développement de la méthode d’analyse complète décrite ici, nous remercions l’Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directrice – Krista La Perle, DVM, PhD) pour les services d’histologie et d’immunohistochimie et le Pathology Imaging Core pour le développement et l’analyse d’algorithmes.

L’utilisation des animaux a suivi les règlements de l’Université sur les ressources des animaux de laboratoire (ULAR) en vertu du protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’OSU 2007A0120-R4 (PI: Dr Gina Sizemore).
1. Injection de cellules cancéreuses du sein dans la veine de la queue
<ol><li>Préparation des cellules et seringue pour injection<ol>
<li>Plaquez un nombre approprié de cellules en fonction du nombre de souris et de la concentration cellulaire à utiliser. REMARQUE: Le nombre de cellules injectées et le temps nécessaire au développement des métastases dépendront de la lignée cellulaire utilisée et devront être optimisés. Dans cette démonstration, 1 x 106 cellules MDA-MB-231 sont injectées par voie intraveineuse dans des souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), et des lésions pulmonaires macroscopiques sont observées au plus tard 24 jours après l’injection. Pour la lignée cellulaire tumorale mammaire murine MVT17, 3 x 106 cellules sont injectées à des souris FVB/N immunocompétentes avec de nombreuses métastases pulmonaires observées en 14 jours22,23.</li>
		<li>Aspirer les milieux et rincer les plaques cellulaires avec 1x PBS. Trypsiniser les cellules en volume minimal, ajouter un volume approprié de milieu et compter les cellules à l’aide d’un hématocytomètre ou d’une autre méthode préférée. Le bleu de trypan (0,4 %) ou d’autres colorants cellulaires vivants/morts peuvent être utilisés pour déterminer le nombre de cellules viables.</li>
		<li>Cellules à granulés en tournant à 180 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Remettre en suspension un nombre approprié de cellules dans du PBS stérile 1x de telle sorte qu’un volume de 100 μL soit injecté par souris. Gardez la suspension cellulaire sur la glace pour maintenir la viabilité.</li>
		<li>Avant l’injection, remettez soigneusement en suspension les cellules avec une pipette de 200 μL ou 1 mL pour éviter l’agglutination. Prélever 100 μL dans une seringue à insuline de 28 G (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Éliminez les bulles d’air en maintenant la seringue verticale, en tapotant sur la seringue et en ajustant lentement le piston. L’injection de bulles d’air dans la veine est susceptible de provoquer une embolie air/gaz qui peut être fatale.</li>
	</ol></li>
	<li>Injection latérale de la veine caudale REMARQUE: Pour les tests expérimentaux de métastases du cancer du sein, les injections sont effectuées sur des souris femelles de > de 6 semaines.<ol>
<li>Manipulez la souris par la queue et faites glisser l’animal dans un tube/dispositif de retenue fendu d’une taille appropriée (voir le tableau des matériaux pour le dispositif de retenue utilisé).</li>
		<li>Insérez la partie plug du dispositif de retenue et positionnez la souris sur le côté de manière à ce que sa veine latérale de la queue soit facile à voir. La souris a une artère ventrale alignée avec les organes génitaux, une veine dorsale et deux veines caudales latérales.</li>
		<li>Nettoyez la surface de la queue de la souris avec une lingette aseptique. Saisissez la queue entre l’index et le pouce avec la main non dominante et appliquez une légère tension.</li>
		<li>En commençant par la partie distale de la queue, insérez l’aiguille parallèlement à la veine avec l’extrémité biseautée.</li>
		<li>Si cela est autorisé, récapitulez soigneusement l’aiguille et pliez-la à un angle de 20 à 30 °. Une approche à une seule main ou un dispositif de récapitulation à l’aiguille est fortement recommandé. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’aspirer car cela peut provoquer l’effondrement de la veine. Cependant, un petit éclair de sang peut être vu lors de la première place. L’aiguille avancera en douceur dans la veine avec un placement approprié.</li>
		<li>Distribuer lentement le volume complet dans la veine. Il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé.</li>
		<li>Si une résistance se fait sentir, retirez rapidement l’aiguille de la seringue. Si nécessaire, réinsérez l’aiguille (idéalement pas plus de 3 tentatives) en vous déplaçant vers l’extrémité proximale de la queue ou la veine latérale opposée.</li>
		<li>Un petit volume de sang sera probablement déplacé après l’injection. Appliquez une légère pression avec de la gaze stérile et essuyez avec une lingette aseptique.</li>
		<li>Jetez rapidement la seringue dans un contenant approprié pour objets tranchants.</li>
		<li>Remettez la souris dans une cage propre et ventilée et surveillez les signes de détresse.</li>
		<li>Surveillez les souris 2-3x / semaine pour détecter les signes de formation de métastases (respiration laborieuse, posture voûtée, perte de poids) et de détresse générale. Le temps de développement des métastases dépendra de la lignée cellulaire et de la souche de souris.</li>
		<li>Si vous utilisez un dispositif d’imagerie d’animaux vivants in vivo, imagez des souris immédiatement après l’injection de veines caudales pour confirmer l’injection réussie de cellules et obtenir des données de temps « zéro » (des détails spécifiques sur l’imagerie par bioluminescence in vivo ne sont pas inclus ici, mais sont décrits par Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixation du tissu pulmonaire et analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique
<ol><li>Gonflage du tissu pulmonaire pour maintenir le format structurel des poumons pour l’histopathologie<ol>
<li>Après avoir suivi les procédures d’euthanasie approuvées (p. ex. dioxyde de carbone à un déplacement de 30 à 70 % du volume de la chambre/min), fixer la carcasse de la souris à une planche de dissection avec des broches. Vaporisez ou appliquez de l’éthanol à 70% pour garder la fourrure de la souris à l’écart pendant la dissection. REMARQUE: L’asphyxie au dioxyde de carbone peut provoquer une hémorhage pulmonaire comme lésion de fond attendue, en particulier à des débits plus lents.</li>
		<li>Ouvrez le thorax avec une incision médiane, étendez l’incision crânienne / caudale à travers le péritoine et coupez le diaphragme en saisissant le processus xyphoïde.</li>
		<li>À l’aide d’un jeu de ciseaux séparé pour ne pas ternir les lames, coupez les côtes de chaque côté du sternum et retirez soigneusement la cage thoracique en laissant de la place aux poumons pour se dilater.</li>
		<li>Isolez la trachée en enlevant les glandes salivaires sous-maxillaires et la musculature infrahyoïde. Placer des broches de chaque côté de la trachée peut empêcher les mouvements indésirables lors de l’insertion de l’aiguille.</li>
		<li>Remplissez une seringue de 26 G avec 2-3 mL de formol tamponné neutre à 10% et insérez-la dans la trachée.</li>
		<li>Injectez lentement du formol et surveillez l’expansion des poumons (nécessite généralement environ 1,5 mL de formol).</li>
		<li>Une fois que le formol commence à s’échapper des poumons (évitez le gonflage excessif), pincez la trachée avec une pince, retirez l’aiguille de la seringue et détachez tout l’appareil respiratoire. Placez les poumons, le cœur, etc. directement dans le formol car une coupe supplémentaire des tissus peut être effectuée après la fixation.</li>
		<li>Traitement complet, incorporation, sectionnement des tissus et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) à l’aide de méthodes standard.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique<ol>
<li>Scannez des sections pulmonaires colorées H&E sur un scanner de diapositives haute résolution à un grossissement de 40x (Figure 3).</li>
		<li>Importez des images dans un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Visiopharm Image Analysis) pour quantifier les métastases pulmonaires. REMARQUE: Nous recommandons aux nouveaux utilisateurs d’obtenir une formation sur site ou en ligne pour utiliser le logiciel d’analyse d’images. De nombreux webinaires sont également disponibles sur la page Web commerciale.</li>
		<li>Sélectionnez l’application Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dans la bibliothèque d’applications du logiciel. REMARQUE: Le but de cette application est d’étiqueter et de quantifier les métastases pulmonaires sur les lames colorées H & E. Dans le cadre de l’application 10118 H&E Lung Metastasis, la première étape de traitement d’image segmente le tissu pulmonaire avec l’application Tissue Detection. La deuxième étape de traitement d’image utilise l’application Metastasis Detect qui identifie les métastases à l’intérieur du tissu pulmonaire. Les métastases sont identifiées par la forme avec des régions qui sont soit trop déformées, soit trop rouges ou trop clairsemées pour être identifiées comme des métastases.</li>
		<li>Ajustez les paramètres définissant la forme et la rareté pour qu’ils s’adaptent au mieux aux images représentatives. Les zones segmentées des métastases tumorales et du tissu pulmonaire normal peuvent être affichées à l’aide d’étiquettes de couleur différentes pour chaque type de tissu. REMARQUE : Dans le cas où l’application ne peut pas séparer avec précision les métastases du tissu pulmonaire normal, une application personnalisée utilisant le programme Visiopharm Decision Forest peut devoir être écrite comme cela a été fait pour les expériences (voir Figure 2 et Figure 3). Les détails pour l’écriture d’un algorithme personnalisé suivent ci-dessous. Sinon, passez à l’étape 2.2.9.</li>
		<li>Ouvrez le programme Decision Forest, qui fonctionne en formant plusieurs classes [c.-à-d. tissu pulmonaire (non néoplasique), métastases, globules rouges, épithélium et / ou espace blanc] sur une image souhaitée. Dans la figure 2, les métastases tumorales sont bleues, le tissu normal est vert et l’épithélium bronchiolaire est jaune. En outre, les globules rouges sont dans les espaces rouges et les espaces d’air en rose.</li>
		<li>Suivez la série de questions par oui ou par non pour former correctement chaque classe à une image. La précision de l’algorithme déterminera le nombre de questions oui/non. Pour l’analyse, l’algorithme/l’application personnalisé a été écrit avec une précision définie sur 50 (plage 0-100).</li>
		<li>Ajustez les fonctionnalités pour chaque classe en appliquant des filtres pour affiner, flouter, trier par forme, etc. afin d’améliorer la précision de l’algorithme/de l’application. Visiopharm affiche chaque classe à travers un ou plusieurs objectifs appelés fonctionnalités. Les fonctionnalités modifient la façon dont la classe voit l’image pour faire ressortir certaines couleurs ou intensités. REMARQUE: Pour l’algorithme personnalisé, les métastases mesurant 8500 μm2 et plus sont étiquetées et mesurées comme métastases. Cela tient compte de la variance de taille et des métastases trop petites pour être détectées. Les petites zones déformées et les petites zones métastatiques inférieures à 8500 μm2 ont été incluses dans la quantification tissulaire normale.</li>
		<li>Enregistrez les paramètres modifiés à partir de l’application ou de l’algorithme personnalisé, puis appliquez l’algorithme / l’application à un ensemble entier ou à une série de tissus colorés H & E.</li>
		<li>Enfin, exportez toutes les variables de sortie, y compris celles répertoriées dans le tableau 1. L’aire en microns carrés (μm2) peut être quantifiée pour chaque type de tissu et les pourcentages sont dérivés de la surface nette nette totale de l’échantillon (c.-à-d. le tissu total moins l’espace d’air).</li>
		<li>Lors de la création d’un algorithme personnalisé, examinez les annotations tissulaires en consultation avec un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists pour assurer des mesures précises et différencier les types de tissus.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method.">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).</li><li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer.">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist.">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li><li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microscopy,+Image+Analysis,+and+Virtual+Slide+Repository.">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que les chercheurs continuent d’utiliser l’injection intraveineuse de cellules tumorales comme modèle expérimental pour les métastases, les pratiques standard pour analyser la charge tumorale métastatique qui en résulte font défaut. Dans certains cas, des différences significatives dans la charge tumorale métastatique lors de la manipulation de lignées cellulaires particulières et / ou de l’utilisation de composés chimiques peuvent être observées macroscopiquement. Cependant, dans d’autres cas,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Bien qu’il s’agisse d’un processus très complexe et inefficace1, les métastases contribuent de manière significative à la morbidité et à la mortalité des patients atteints de cancer2. En fait, la plupart des décès liés au cancer sont attribués à la propagation métastatique de la maladie3,4. Pour que les cellules tumorales réussissent à métastaser, elles doivent se détacher du site primaire, envahir par le stroma adjacent, s’intravaser dans la circulation sanguine ou lymphatique, se rendre au lit capillaire d’un site secondaire, extravaser dans le tissu secondaire et proliférer ou se développer pour former des lésions métastatiques5. L’utilisation de modèles murins a été essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’ensemencement et de la croissance métastatiques6,7. Ici, nous nous concentrons sur les métastases du cancer du sein, pour lesquelles des modèles murins génétiquement modifiés ainsi que des méthodes de transplantation sont souvent utilisés – chacun avec son propre ensemble d’avantages et de limites.
Les modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés utilisent des promoteurs spécifiques de la glande mammaire, y compris MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) et WAP (Whey Acidic Protein), pour stimuler l’expression des transgènes dans l’épithélium mammaire8. Les oncogènes, y compris l’antigène T moyen polyoma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 et le virus simien 40 (SV40) ont été exprimés de cette manière9,10,11,12,13, et bien que ces modèles génétiques soient utiles pour étudier l’initiation et la progression de la tumeur primaire, peu se métastasent facilement vers des organes distants. De plus, ces modèles génétiques murins sont souvent plus longs et plus coûteux que les modèles de métastases spontanées ou expérimentales. Compte tenu de la limitation de la plupart des modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés pour étudier les métastases, les techniques de transplantation sont devenues des méthodes attrayantes pour étudier ce processus complexe. Cela comprend l’injection orthotopique, veineuse de la queue, intracardiaque et intracrânienne de lignées cellulaires appropriées.
Bien que plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein métastasent facilement après une injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire14,15, la consistance et la reproductibilité de la charge tumorale métastatique peuvent être un défi, et la durée de telles études peut être de l’ordre de plusieurs mois. Pour évaluer les métastases pulmonaires, en particulier, l’injection intraveineuse dans la veine de la queue est souvent une méthode plus reproductible et plus rapide, la propagation métastatique se produisant généralement en l’espace de quelques semaines. Cependant, étant donné que le modèle d’injection intraveineuse contourne les étapes initiales de la cascade métastatique, il faut faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats de ces études. Dans cette démonstration, nous montrons l’injection de cellules tumorales mammaires dans la veine caudale ainsi qu’une méthode d’analyse précise et complète.
Même si le milieu de la recherche a fait des progrès importants dans la compréhension du processus complexe des métastases du cancer du sein, on estime que plus de 150 000 femmes sont actuellement atteintes d’un cancer du sein métastatique16. Parmi les personnes atteintes d’un cancer du sein de stade IV, >36 % des patientes ont des métastases pulmonaires17; toutefois, le profil et l’incidence des métastases propres au site peuvent varier en fonction du sous-type moléculaire18,19,20,21. Les patientes atteintes de métastases pulmonaires associées au cancer du sein ont une survie médiane de seulement 21 mois, ce qui souligne la nécessité d’identifier des traitements efficaces et de nouveaux biomarqueurs pour cette maladie17. L’utilisation de modèles expérimentaux de métastases, y compris l’injection intraveineuse de cellules tumorales, continuera de faire progresser nos connaissances sur cet important défi clinique. Lorsqu’elles sont combinées à la pathologie par imagerie numérique et à la méthode d’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique décrite dans ce protocole, les injections de veines de la queue sont un outil précieux pour la recherche sur les métastases du cancer du sein.

<table><tbody><tr><td>alcohol prep pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>&lt;strong&gt;for cleaning tail prior to injection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>dissection scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>&lt;strong&gt;for mouse dissection and lung tissue inflation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>used for resuspending tumor cells for injection</td></tr><tr><td>ethanol (70 % solution)</td><td>OSU</td><td></td><td>used to minimize mouse&#039;s fur during dissection; use caution - flammable</td></tr><tr><td>Evan&#039;s blue dye</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>cell culture media additive; used at 10% in DMEM</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>for dissection and lung tissue inflation</td></tr><tr><td>FVB/NJ mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>syngeneic mouse strain for MVT1 cells</td></tr><tr><td>hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>for use in cell culture to obtain cell counts</td></tr><tr><td>insulin syringe (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>for tail-vein injections (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>human breast cancer cell line</td></tr><tr><td>MVT1 cells</td><td></td><td></td><td>mouse mammary tumor cells</td></tr><tr><td>needles (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>used to inflate the mouse&#039;s lungs</td></tr><tr><td>neutral buffered formalin (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>cell culture media additive</td></tr><tr><td>sterile gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>for applying pressue to mouse&#039;s tail if bleeding occurs</td></tr><tr><td>syringe (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>used to inflate mouse lung tissue</td></tr><tr><td>tail-vein restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>used to restrain mouse for tail-vein injections</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>used in cell culture to assess viability</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>used in cell culture to detach tumor cells from plate</td></tr></tbody></table>

pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells

Les métastases, principale cause de morbidité et de mortalité chez la plupart des patients atteints de cancer, peuvent être difficiles à modéliser précliniquement chez la souris. Peu de modèles de métastases spontanées sont disponibles. Ainsi, le modèle expérimental de métastases impliquant l’injection de lignées cellulaires appropriées dans la veine caudale est un pilier de la recherche sur les métastases. Lorsque des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine latérale de la queue, le poumon est leur site préféré de colonisation. Une limitation potentielle de cette technique est la quantification précise de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Alors que certains chercheurs comptent les macrométastases d’une taille prédéfinie et/ou incluent des micrométastases après la coupe des tissus, d’autres déterminent la zone des lésions métastatiques par rapport à la zone tissulaire normale. Ces deux méthodes de quantification peuvent être extrêmement difficiles lorsque la charge métastatique est élevée. Ici, nous démontrons un modèle d’injection intraveineuse de métastases pulmonaires suivi d’une méthode avancée pour quantifier la charge tumorale métastatique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ce processus permet d’étudier plusieurs paramètres du point final, y compris la taille moyenne des métastases, le nombre total de métastases et la zone totale des métastases, afin de fournir une analyse complète. De plus, cette méthode a été examinée par un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists (SEK) pour en assurer l’exactitude.

Si vous utilisez des cellules non marquées pour l’injection de veines de la queue, il peut être difficile de confirmer la colonisation pulmonaire jusqu’à (1) le moment de la nécropsie si des macrométastases peuvent être observées ou (2) après une analyse histologique si des métastases microscopiques existent. Avec une charge de tumeur pulmonaire métastatique étendue, les souris auront une respiration laborieuse. Comme pour toute étude tumorale, les souris doivent être surveillées attentivement tout au l...

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.8K vues.  The Ohio State University Medical Center. L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Vidéo: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Assay Métastases expérimentales

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Médecine

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

L&#39;injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Résumé

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