Cette méthode peut aider à étudier les différences dépendantes du sexe dans les niches névrogènes, et à comprendre leur neuroplasticité, des changements qui soulignent les interactions sociales dans le campagnol des Prairies. L’analyse des neurosphères est un excellent outil pour déterminer le potentiel de prolifération et de différenciation des cellules souches et progénitrices neurales. Pour commencer, placez une boîte de Pétri sur une surface entourée de glace.
Déposer le cerveau sur le plat et ajouter 20 millilitres de solution de lavage à froid. Dans le plan coronal, diviser le cerveau en deux blocs de tissu à l’aide d’un scalpel, effectuant la coupe au niveau de bregma dans l’axe antérieur-postérieur. Extraire la zone sous-ventriculaire, ou VZ, tissu du bloc rostral, et le gyrus bosselé, ou DG, tissu du bloc caudal.
Pour disséquer la ZV, tenez l’un des hémisphères avec un forceps Dumont, et insérez les extrémités fines d’un deuxième forceps sous le tissu qui aligne le caudate-putamen. Ouvrez les forceps le long de l’axe dorsal-ventral pour séparer le tissu, et recueillez le VZ dans un tube de centrifugeuse avec deux millilitres de solution froide de lavage. Ne pas mettre en commun les tissus de plus de deux animaux.
Répétez la microdissection dans l’autre hémisphère et stockez le tube avec le tissu sur la glace. Pour disséquer le DG, utilisez un scalpel pour faire une coupe coronale dans le bloc caudal, pour obtenir deux tranches dans lesquelles la formation hippocampale est observée. Utilisez des forceps Dumont pour tenir l’une des tranches et faites une coupe horizontale entre le DG et le CA1 avec un autre forceps.
Ensuite, faites une incision verticale entre le DG et le CA3, pour séparer le DG. Répétez la dissection dans l’autre hémisphère de la première tranche, puis dans les deux hémisphères dans la deuxième tranche. Recueillir les quatre pièces DG de chaque campagnol dans un tube de centrifugeuse. Placez les tubes de centrifugeuse à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et attendez environ 10 minutes que les fragments de tissu se précipitent par gravité.
Ensuite, retirez la solution de lavage et ajoutez un millilitre de solution enzymatique chaude à chaque tube. Incuber les tubes à 37 degrés pendant 10 minutes. Pour désintégrer les fragments de tissu, pipette de haut en bas avec une pointe d’un millilitre, mais ne pipette plus de 30 fois.
Répétez l’incubation à 37 degrés Celsius, puis pipette le tissu à nouveau. Ajouter neuf millilitres de N-2 moyen à chaque tube pour diluer le traitement enzymatique, et centrifuger les tubes à 200 fois g pendant quatre minutes. Jeter le supernatant, laver les cellules avec 10 millilitres de N-2 moyen, et répéter la centrifugation.
Retirez le supernatant de chaque tube et resuspendez les granulés cellulaires de la ZV et du DG en deux millilitres et un millilitre du milieu B-27, respectivement. Filtrer chaque suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 micromètres pour enlever tout tissu non digéré. Culture des cellules filtrées dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits, en utilisant deux puits pour la VZ et un puits pour la DG. Ajouter 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance fibroblaste 2, et 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique à chaque puits, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et une humidité élevée pendant 48 heures.
Après l’incubation, retirer la moitié du milieu de culture et le remplacer par un milieu B-27 frais, complété par des doubles concentrations des facteurs de croissance. Répétez ce processus tous les trois jours. Les jours où il n’est pas nécessaire de changer le milieu de culture, ajouter des facteurs de croissance à une concentration finale de 1X.
Des neurosphères ont été formées à partir des cellules souches neurales isolées de la zone sous-ventriculaire et ont bosselé le gyrus des campagnols adultes femelles et mâles des Prairies. Bien qu’il y ait eu des débris dans la culture primaire, seules les neurosphères étaient présentes après le premier passage. Un plus grand nombre de neurosphères ont été obtenues de la zone sous-ventriculaire femelle que de la zone sous-ventriculaire masculine, ou du gyrus bosselé des femelles et des mâles, ce qui suggère que le nombre de neurosphères obtenues dépend de la zone proliférante et du sexe campagnol.
Le diamètre des neurosphères a été mesuré les jours 8, 11 et 14. Il a augmenté progressivement pour les campagnols mâles et femelles dans les deux régions neuronales, mais les neurosphères dérivées du cerveau masculin étaient plus petites par rapport à celles dérivées du cerveau féminin. Les neurosphères adhérentes ont été caractérisées le sixième jour en présence de facteurs de croissance, ou le jour 15 sans facteurs de croissance.
Au sixième jour, dans des conditions indifférenciées, les cellules dérivées de la neurosphère ont exprimé Nestin, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux. Il a également été possible d’identifier les cellules doublecortine-positives et le marqueur de prolifération Ki-67, qui indiquent la présence de précurseurs neuronaux ou de neurones immatures. Cependant, l’absence de colocalisation de Ki-67 avec DCX a suggéré la présence des neuroblastes post-mitotic.
Au jour 15, dans des conditions de différenciation, des neurones matures et des cellules avec le phénotype gliales ont été trouvés, démontrant le potentiel de différenciation des cellules isolées. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que le fait de pouvoir reconnaître et d’avoir une pratique antérieure en microdissection est fondamental pour isoler uniquement les cellules des niches névrogéniques. À la suite de ce protocole, des expériences peuvent être conçues pour identifier les mécanismes impliqués dans la prolifération, la différenciation et la survie des cellules souches et progénitrices neurales, processus encore inconnus dans le campagnol des Prairies.
