Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros au National Institutes of Health, NINDS. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire de médecine moléculaire et de neurosciences, Rick Dreyfuss pour aider à la microscopie et Pamela C. Tamiser pour son aide à l&#39;édition.

Remarque: Pour la culture de routine de progéniteurs neuronaux et cellules de la lignée oligodendrogliome, l&#39;incubation se fait à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Tous les 2 jours, le milieu est remplacé à partir de 50 à 100% de milieu frais si la culture est confluente 40-70%. Au moment de la confluence proche, les cultures sont passées à 2-2.5e6/T75 flacon généralement sur une base hebdomadaire. 1. Préparer le flacon couché <ol><li> Pour préparer des flacons revêtus de diluer 5 mg de poly-D-lysine (PDL) dans 100 ml d&#39;eau déminéralisée (eau déminéralisée), puis les enrober flacons T75 avec 50 pg / ml de PDL à la température ambiante (RT) dans l&#39;obscurité. Après 1 ½ h, aspirer le PDL et rincer les flacons une fois avec de l&#39;eau déminéralisée. Laissez les flacons secs avant l&#39;ensemencement des cellules (tableau 1). </li></ol> 2. À partir de différenciation des cellules progénitrices neurales progénitrices oligodendrocytes en dérivés (AOP) Le protocole estolate des cellules progénitrices du système nerveux central est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Les cellules souches du système nerveux central ont été isolés à partir du télencéphale d&#39;un cerveau de 8 semaines de gestation du fœtus, obtenus conformément aux directives du NIH. <ol><li> Accroître la population multipotentielle des cellules progénitrices neurales sur PDL flacons revêtus en milieu neurobasal additionné de 25 ng / ml de bFGF et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) (figure 1A). Ne les utilisez pas si élevé que le passage 11 (p11). </li><li> Commencent à se différencier les cellules progénitrices neurales lorsque la culture est d&#39;environ 70% de confluence. </li><li> Assurez milieu de différenciation des oligodendrocytes complète à l&#39;aide du DMEM sans sérum / JAMBONS milieu F12 01:01 complétée par la sérum albumine bovine, de L-glutamine, la gentamicine, composants N2, T3, Chut, NT-3, bFGF et PDGF-AA (tableau 1) . Ce milieu sera définie comme moyen oligo des facteurs de croissance (oligo moyenne + GF). </li><li> Retirer Progenmédias Itor des flacons, rincer les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis ajouter du milieu oligo + GF (détails décrits en 2.3) pour commencer la différenciation des oligodendrocytes. Seules les cellules engagées dans la lignée oligodendrogliome va croître (figure 1B). Culture des cellules dans ce milieu pendant 3 semaines. </li><li> Chaque semaine, lorsque les cellules sont à confluence, passage de 90-95% les utilisant de la trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml pour un flacon T75). Transférer le support d&#39;ensemble à partir des cellules à un passage dans un tube conique de 50 ml, ce milieu conditionné est utilisé pour étancher la trypsine. Assurez-vous de ne pas dessécher les cellules. Ensuite, ajoutez la trypsine. </li><li> Incuber les cellules à la trypsine pendant 5 min à température ambiante, en tapotant doucement le flacon plusieurs fois pour aider le détachement des cellules. </li><li> Étancher la trypsine en ajoutant 4-5 ml de milieu conditionné dans le ballon avec les cellules individuelles. </li><li> Transférer le milieu et les cellules de la même 50 ml tube conique. Centrifuger le milieu et les cellules à 1200 rpm (~300 xg) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire, doucement basculer le tube, puis ajouter du milieu frais oligo + GF. Doucement moyen pipette et de cellules de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. </li><li> Compter le nombre de cellules de transfert, et 2.5e6 dans chaque nouvelle PDL revêtu T75 ballon. </li></ol> 3. Étape finale dans la différenciation des oligodendrocytes <ol><li> Après 3 semaines de culture en oligo moyenne + GF, lorsque les cellules sont à confluence de 70-80%, démarrez le processus final de différenciation (figure 1C). </li><li> Préparer le milieu de la même manière que le moyen oligo + GF, mais sans adjonction de quatre GF: Shh, NT-3, bFGF et du PDGF-AA. Ce milieu sans le GF quatre seront définis comme moyen oligo - GF. </li><li> Aspirer le milieu oligo + GF du flacon, rincer une fois avec du PBS puis ajouter un volume total de 16 ml de milieu, dont ¾ (12 ml) est un oligo moyennes - GF et ¼ (4 ml) est PDN milieu conditionné par 6-10 Jours). L&#39;utilisation d&#39;un milieu conditionné provenant PDN n&#39;est pas critique pour le processus de différenciation ou de la survie des cellules. Nous avons en fait constaté que seulement le contact direct avec les cellules de l&#39;AOP PDN dans des expériences de co-culture a eu un effet sur la durée de la survie PDO. Le temps de survie moyen en oligo - GF pourrait être prolongée jusqu&#39;à deux ou trois semaines si les cellules AOP sont co-cultivées avec des cellules PDN. Le protocole de différencier des cellules souches neurales dans PDN est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Retrait du facteur de croissance à partir des résultats de milieux de culture en culture progressivement différenciées des cellules avec plusieurs processus (figure 1D). </li></ol> 4. Essai de cytométrie en flux Le test de cytométrie en flux compare l&#39;acquisition de marqueurs oligodendrocytes au cours du processus de différenciation par rapport à ceux de leur population parentale. <ol><li> Utilisez pro neuronesgéniteurs que le contrôle. Semences cellules PDO à 2,5.10 6 cellules dans deux flacons T75 recouvertes de poly-D-lysine en oligo moyenne + GF. </li><li> Une semaine plus tard, remplacer moyenne avec oligo milieu frais + GF dans des flacons en tant que culture de contrôle pour la viabilité cellulaire, tandis que d&#39;autres flacons ont oligo moyennes - GF. </li><li> Pour dissocier les cellules AOP dans les médias utilisent 20 U / ml de papaïne et la trypsine pas. En effet, la papaïne a un doux effet sur les cellules au cours de la dissociation préserver la morphologie cellulaire. </li><li> Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Earle (EBSS) dans un flacon à la papaïne. Placer la fiole à 37 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que la papaïne est totalement dissous et la solution apparaît clairement. C&#39;est la solution la papaïne utilisée pour dissocier les cellules. </li><li> Ajouter 0,5 ml de EBSS à une désoxyribonucléase I (DNase) flacon (tableau 1). Mélanger doucement. Ajouter 0,25 ml de cette solution dans le flacon de la papaïne dissous. Cette préparation contient une concentration finale d&#39;environ 20 U / ml et la papaïne 00,005% DNase. </li><li> Lieu papaïne solution (comme décrit ci-dessus) sur les cellules et incuber à 37 ° C pendant 15-30 min, à surveiller le détachement des cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope. Arrêter la réaction avec 5 ml de milieu avec ou sans GF et centrifuger à 1200 tours par minute pendant 7 min. </li><li> Transfert culots cellulaires des deux flacons en deux différents tubes de 5 ml en polypropylène et lavez-les avec le milieu physiologique normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 10 mM glucose) additionné de 1 mg / ml sérum-albumine bovine (BSA + NPM). </li><li> Effectuer surface immunomarquage à 4 ° C pendant 20 min en utilisant de manière appropriée spécifiques et titré les anticorps primaires pour A2B5, O4, GalC (tableau 2). </li><li> Laver les cellules avec NPM + BSA à 4 ° C pendant 5 minutes et les incuber avec des anticorps secondaires à 4 ° C pendant 20 min (tableau 2). </li><li> Pour colorer les antigènes intracellulaires, y compris la nestine, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), classe III et êtreta;-tubuline, protéine basique de myéline et (MBP) (tableau 2), fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% (PFA) pendant 20 min à température ambiante et perméabiliser avec de l&#39;éthanol 70% froid pendant 15 min à -20 ° C. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires (tableau 2). </li><li> Faire la distinction entre les cellules intactes et les débris subcellulaire lors de l&#39;analyse par cytométrie en flux, colorer les cellules avec 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dichlorhydrate (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> En optimisant le protocole ci-dessus, nous avons effectué toutes les expériences de contrôle appropriés pour confirmer la spécificité de chaque réactif immunologique. En bref, pour les anticorps directement marqués, le contrôle négatif approprié était un anticorps directement conjugués de la classe même isotype d&#39;immunoglobulines (ou sous-classe) et conjugué fluorochrome comme anticorps primaire (c.-à-isotype contrôle). Pour immunomarquage indirect des anticorps primaires, le contrôle négatif approprié wcomme anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome l&#39;intérêt que spécifiquement ciblé la classe d&#39;immunoglobulines (ou sous-classe) de l&#39;hôte dans lequel l&#39;anticorps primaire a été généré. Lorsque anticorps primaires de plusieurs hôtes (souris, lapin, poulet) ont été utilisés ensemble, nous avons utilisé l&#39;anticorps secondaire ciblant l&#39;anticorps primaire de chaque hôte et chaque anticorps secondaire utilisé est généralement contre-adsorbé contre les immunoglobulines des autres hôtes pour minimiser les contre- accueillir immunoréactivité. Les contrôles positifs inclus immunomarquage direct ou indirect des préparations cellulaires connues pour exprimer les antigènes d&#39;intérêt en utilisant soit des réactions immunologiques directs ou indirects avec les anticorps primaires spécifiques de ces antigènes. Les méthodes d&#39;optimisation ci-dessus ont été effectuées une fois pour chaque type d&#39;immunocoloration expériences. Immunoréactions de contrôle n&#39;a pas révélé croisée significative épitope immunoréactivité des anticorps primaires et secondaires. La cytométrie en flux a été réalisée sur uniformesuspension des cellules marquées par fluorescence en utilisant une cellule SE FACVantage trieur (BD Biosciences, San Jose, CA) équipé de trois lasers qui fournissent des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation accordés à 488 nm, 647 nm, et une large UV (351-364 nm) (Figure 2) . </li></ol> 5. Immunofluorescence Remarque: Pour les expériences d&#39;immunofluorescence, PDO sont plaqués en oligo moyenne + GF ou oligo moyennes - GF à 2.5e5 plaques à 6 puits revêtus de PDL. Les cellules sont fixées à 2% de PFA à différents moments après le retrait des facteurs de croissance. L&#39;anticorps tache est réalisée sur plaques de 6 puits en plastique au lieu de lamelles de verre. <ol><li> Retirez le support et ajouter les 2% de PFA. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Jeter PFA. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, à 5 min à chaque fois. Veillez à ne pas dessécher les cellules. </li><li> Perméabiliser les cellules pour les marqueurs intracellulaires qui utilisent la solution de triton 0,25% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Pour éviter la liaison non spécifique des cellules de bloc, fou 10 min avec HHG (1 mM de tampon HEPES, de sérum de cheval à 2%, et de sérum de chèvre à 10% dans une solution saline équilibrée de Hank). Diluer anticorps primaires spécifiques (tableau 2) à une concentration prédéterminée dans HHG. Placez anticorps dilué sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur l&#39;agitateur ou à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. Diluer appropriées Anticorps secondaires (tableau 2) couplées à un fluorochrome à une concentration prédéterminée dans HHG. Placer le mélange dilué d&#39;Anticorps secondaires sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur un agitateur dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Pour éviter photoblanchiment ajouter 10 ul de prolonger l&#39;or avec du DAPI dans les cellules et placer une lamelle de verre sur le dessus d&#39;eux. Visualisez les cellules marquées à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (figure 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li><li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons.">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche-defying+feat:+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus.">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li><li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells.">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li><li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche.">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li><li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain.">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li><li>Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+(O4+GalC-)+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta.">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes.">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li><li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro.">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li><li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes:+biology+and+pathology.">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li><li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+into+the+glial+reservoir:+cells+committed+to+remaining+uncommitted.">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li><li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain.">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5 (2009).</li><li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures.">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li><li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination/remyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism.">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li><li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole décrit la façon de calculer les oligodendrocytes à partir de fœtus humains primaires cellules progénitrices neurales et de caractériser leur phénotype en utilisant la cytométrie en flux à la fois et immunofluorescence. L&#39;expansion et la croissance des progéniteurs neuronaux du système nerveux central du fœtus a été très bien décrit 1-4. Cependant, l&#39;obtention d&#39;oligodendrocytes humains suffisants pour une expérimentation in vitro reste difficile, mê...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12 01:01 </td><td> Omega scientifique </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 pg / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> Composants N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 pg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> Flacons DNase </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Or ProLong avecDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primaire Abs (tout à 1 ug / ml) </td><td></td><td> Isotype espèces </td><td> Source </td><td> Secondaire Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Cytométrie en flux </td></tr><tr><td> A2B5-biotine </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Cadeau J. Nielson </td><td> Streptavidine PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Cadeau de J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Souris </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Poulet </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestine </td><td> Souris </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> tubuline βIII </td><td> Souris </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochimie </td></tr><tr><td> tubuline βIII (1:1,500) </td><td> Souris </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Poulet </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> Anticorps tableau 2 (Abs) utilisés pour la cytométrie en flux et des dosages immunocytochimie conjugués d&#39;anticorps: PE, la phycoérythrine; PETR, la phycoérythrine-Rouge Texas; AMCA, amino-méthyl-coumarine-acétate; Cy, cyanine, FITC, l&#39;isothiocyanate de fluorescéine Ig:.. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: chèvre anti-souris; gαrb: chèvre anti-lapin; dαck: donkey anti-poulet. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

Différenciation des progéniteurs neuronaux de l&#39;homme dans les types de cellules neuronales et gliales propose un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement neuronal lignée cellulaire. En expansion in vitro des progéniteurs neuronaux du tissu du SNC du fœtus a été bien caractérisée. Malgré l&#39;identification et l&#39;isolement des progéniteurs gliales de l&#39;adulte humain sous-corticale de la substance blanche et le développement des conditions de culture différentes de différenciation directe des cellules progénitrices neurales foetales en oligodendrocytes de myéline produire, acquérir suffisamment oligodendrocytes humains pour une expérimentation in vitro reste difficile. Différenciation des galactocérébroside + (GalC) et O4 + précurseurs d&#39;oligodendrocytes ou cellules progénitrices (OPC) à partir de cellules précurseurs neurales ont été signalés à l&#39;aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l&#39;absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture. Il subsiste le besoin d&#39;un système de culture pour produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire apte à une expérimentation in vitro. Culture des oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, être un modèle utile pour étudier la pathogenèse de la neurotropes agents infectieux comme le polyomavirus humain, JCV, que in vivo infecte ces cellules. Ces cellules en culture pourrait également fournir des modèles d&#39;autres maladies de démyélinisation du système nerveux central (SNC). Primaire, du fœtus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (progéniteurs des neurones dérivés, PDN) et les astrocytes (progéniteurs dérivés des astrocytes, PDA) Cette étude montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites se différencier grâce à de nombreux stades de développement lignée oligodendrogliome (progéniteurs des oligodendrocytes dérivées, AOP). Nous cellules progénitrices neurales culture dans du DMEM-F12 sans sérum supplemented avec le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), le facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et de la triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont passées à cellules 2.5e6 par flacons de 75 cm environ tous les sept jours. L&#39;utilisation de ces conditions, la plupart des cellules en culture maintenir une morphologie caractérisée par quelques procédés et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytes, telles que A2B5 et O-4. Quand nous enlevons les facteurs de croissance quatre (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajouter milieux conditionnés provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de processus et de marqueurs spécifiques expresses de la différenciation des oligodendrocytes, comme GalC et de la myéline protéine de base (MBP). Nous avons effectué la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolores pour identifier des marqueurs uniques de oligodendrocytes.

Il est très important de commencer le processus de différenciation à partir d&#39;un 70% -80% culture confluente de cellules progénitrices de neurones (figure 1A). De nombreuses cellules meurent après avoir changé le milieu de culture des progéniteurs à moyen oligo car il inclut des facteurs de croissance spécifiques. Ceci indique que la croissance des cellules progénitrices neurales ne s&#39;engagent pas à un phénotype oligodendrogliome ne seront pas pris en charge par le nouveau média <st...

Watch this Scientific Journal Video about Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain at JoVE.com

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Primaire, l&#39;homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent<em&gt; In vitro</em&gt; Tout en maintenant la capacité de se différencier en neurones et les astrocytes. Ce travail montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites à se différencier par des étapes de la lignée oligodendrogliome par le conditionnement des facteurs de croissance choisis.

Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K vues.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Primaire, l'homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent In vitro Tout en maintenant la capacité de se différencier en neurones et les astrocytes. Ce travail montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites à se différencier par des étapes de la lignée oligodendrogliome par le conditionnement des facteurs de croissance choisis.

Vidéo: Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Recherche

Neurosciences

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...