Le protocole actuel montre en détail l’administration sous-rétinienne des organoïdes rétiniens entiers dans un grand modèle animal, visant à développer des approches de thérapie cellulaire pour la dégénérescence rétinienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’administration d’organoïdes directement au tissu cible, la rétine. La technique vise à traiter les affections dégénératives rétiniennes cécitant avancées, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire ou l’amaurose congénitale léber.
Le Dr Peterson Jones fera la démonstration de la procédure. Pour l’implantation sous-rétinienne des organoïdes, utilisez des ciseaux de ténotomie Stevens pour effectuer une canthotomie latérale de 0,5 à 1 centimètre chez un chat anesthésié à jeun de quatre mois et à jeun de nuit, et placez un spéculum de paupière Barraquer de taille appropriée dans l’incision pour garder les paupières ouvertes avec un assistant chirurgical irriguant régulièrement la cornée avec BSS tout au long de la procédure. Utilisez une pince cornéenne de 0,5 Castroviejo et un petit hémostatique de moustique pour saisir doucement la conjonctive bulbaire à côté du limbe.
Placez deux sutures de soie 6-0 dans la conjonctive immédiatement adjacente au limbe aux positions 4 et 8 heures pour maintenir l’œil dans le regard primaire et rétracter la troisième paupière. Serrez les extrémités des sutures avec de petits hémostatiques de moustiques pour faciliter leur manipulation, et placez une autre suture à la position 12 heures au limbe partiellement à travers l’épaisseur du limbe, en prenant soin de ne pas pénétrer dans l’œil. Nouez lâchement la suture, en coupant l’extrémité courte, et placez une suture de hauban dans la conjonctive immédiatement adjacente au limbe à la position 4 heures pour tenir l’œil et le regard primaire.
Réfléchissez la conjonctive bulbaire entre 10 et 2 heures et utilisez des ciseaux de ténotomie pour inciser la conjonctive à deux ou trois millimètres du limbe. Affaiblir la conjonctive et nettoyer la capsule de Tenon pour exposer la sclérotique aux deux et 10 heures des orifices de vitrectomie à trois à cinq millimètres du limbe. Utilisez des étriers pour identifier les sites de sclérotomie, en évitant les principaux vaisseaux scléraux qui peuvent être proéminents chez le chat.
Planification d’une région de trois millimètres au port d’instruments de 10 heures pour un chirurgien droitier, pré-placer 6-0 ou 7-0 sutures de motif croisé en polyglactine sans attacher aux sites des sclérotomies proposées. Une fois les sutures en place, demandez à l’assistant de saisir les sutures de 12 heures pour aider à maintenir le globe en position et utilisez des pinces Castroviejo de 0,12 millimètre pour maintenir le tissu à côté du site de sclérotomie. Utilise un trocart pour introduire un orifice de vitrectomie de calibre 23 à travers la sclérotique aux positions 2 et 10 heures inclinées vers le nerf optique pour éviter le contact avec la lentille, et utilise des pinces à attacher pour pousser doucement l’orifice d’irrigation afin de déterminer si les pointes peuvent être visualisées dans le vitré.
Demandez à l’assistant de placer une lentille de vitrectomie d’irrigation grossissante Machemer sur la cornée pour permettre la visualisation du segment postérieur de l’œil, et un coupe-sonde de vitrectomie de calibre 23 à travers le port de l’instrument pour effectuer une vitrectomie partielle du tronc. Ensuite, introduisez l’aiguille d’une seringue d’un millilitre contenant un millilitre de solution de triamcinolone dans le port de l’instrument et injectez 250 à 500 microlitres de la suspension cristalline. Lorsque la solution a été administrée, faire avancer la sonde de vitrectomie à travers l’orifice de l’instrument pour se rapprocher de la tête du nerf optique, l’orifice étant orienté vers l’extérieur de la surface rétinienne.
Utilisez le vide poussé pour aider à détacher la face vitréenne de la rétine, insérez l’injecteur à travers l’orifice de l’instrument vers la surface rétinienne et extrudez l’extrémité de la canule. Appuyez doucement sur l’extrémité de la surface rétinienne et demandez à l’assistant de donner une légère pression rapide sur le piston de la seringue pour démarrer le décollement de la rétine, réduisant ainsi la pression d’injection pour permettre une augmentation lente du décollement de la rétine jusqu’à ce que la taille souhaitée soit atteinte. Utilisez une canule de calibre 41 de l’injecteur pour agrandir légèrement le détachement jusqu’à ce que des ciseaux rétiniens puissent être introduits, et retirez l’orifice scléral de 10 heures.
Utilisez ensuite un couteau droit à fente de 2,850 millimètres orienté vers le nerf optique pour éviter de toucher la lentille pour agrandir la sclérotomie à cet endroit. Faites la rétinotomie sur le bleb loin du nerf optique pour éviter d’endommager les fibres nerveuses rétiniennes provenant de la région transplantée, et évitez de couper les principaux vaisseaux rétiniens pour réduire le risque d’hémorragie. Pour implanter les organoïdes, insérez un capillaire en verre chargé d’organoïdes à travers la sclérotomie élargie vers le site de rétinotomie, et utilisez l’extrémité du capillaire pour ouvrir légèrement la rétinotomie afin de permettre l’accès à l’ouverture du bleb sous-rétinien.
Demandez à l’assistant d’appuyer à nouveau lentement sur le piston de l’injecteur pour injecter les organoïdes dans le bleb sous-rétinien. BSS doit procéder organoïdes, les organes, et rincer la rétinotomie ouverte. Lorsque tous les organoïdes ont été délivrés, laissez le capillaire en verre en place pendant quelques secondes avant de retirer lentement le capillaire de l’œil, en prenant soin d’éviter toute libération soudaine de liquide.
Lorsque le capillaire a été enlevé, fermez la sclérotomie en utilisant la suture pré-placée dans un motif croisé. Demandez à l’assistant de retirer l’orifice de perfusion et d’attacher rapidement la suture de sclérotomie et de fermer la péritomie avec les sutures en polyglactine selon un schéma simple et continu. Fermez la cangotomie latérale avec une suture polyglactine 6-0 et des sutures cutanées en huit pour effectuer le canthus latéral et utilisez de simples sutures cutanées interrompues pour fermer le reste de la plaie.
Ensuite, administrez le cocktail de stéroïdes et d’antibiotiques post-chirurgical approprié. La charge organoïde rétinienne pluripotente humaine dérivée de cellules souches peut être confirmée dans la canule en verre du dispositif d’injection et pendant la chirurgie par visualisation directe. La présence des organoïdes dans l’espace sous-rétinien peut être confirmée postopératoirement par un examen ophtalmique et une imagerie du fond d’œil.
Avant l’euthanasie, l’ophtalmoscopie confocale au laser à balayage et l’imagerie par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral peuvent également être effectuées pour évaluer la position des organoïdes. Ces techniques peuvent être utilisées pour démontrer la persistance des organoïdes rétiniens dans l’espace sous-rétinien entre la rétine neurale et l’épithélium pigmentaire rétinien de l’œil receveur. Les analyses histologiques et immunohistochimiques peuvent être utilisées pour illustrer la survie des graphes xénogéniques dans l’espace sous-rétinien d’un gros œil chez un animal immunodéprimé.
Seules les personnes qualifiées en chirurgie vitréo-rétinienne, telles que les ophtalmologistes vétérinaires formés ou les chirurgiens vitréo-rétiniens familiers avec les différences entre les espèces dans l’œil de chat par rapport à l’œil humain, devraient entreprendre cette procédure. La technique présentée dans cette vidéo devrait être applicable à d’autres grands modèles animaux utilisés pour traduire les techniques chirurgicales vitréo-rétiniennes dans les cliniques.
