Les cultures organotypiques du cortex adulte humain sont jusqu’à présent le seul système de test des thérapies à base de cellules souches pour le cortex endommagé qui permet d’étudier l’interaction entre les cellules humaines greffées et les cellules hôtes humaines. Une thérapie testée sur des modèles animaux échoue généralement lorsqu’elle est appliquée dans les milieux cliniques en raison des différences entre les cellules de rongeurs et les cellules humaines. Ici, nous pouvons étudier les cellules greffées, la survie, la différenciation et la fonctionnalité dans un contexte interhumain.
Cette méthodologie nous aidera à comprendre comment les circuits neuronaux fonctionnent dans le cerveau humain, et stimulera également la traduction de ces connaissances dans les milieux cliniques pour améliorer la récupération fonctionnelle après une lésion cérébrale. Raquel Martinez-Curiel, doctorante, et Costanza Aretio-Medina, étudiante à la maîtrise, toutes deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez les inserts de culture dans une plaque à six puits à l’aide d’une pince dans le laboratoire de culture cellulaire sous une hotte ventilée.
Ajouter cinq millilitres du milieu cortical adulte humain sur le fond de l’insert jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la membrane. Évitez la formation de bulles et ajoutez deux millilitres de milieu sur le dessus de l’insert. Avant de transférer les tranches de tissu dans les inserts, équilibrez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins deux heures.
Recueillir le tissu du patient dans la salle d’opération dans un récipient de solution de coupe congelée, bouillonnée et écrasée. Transférez immédiatement le contenant fermé sur de la glace dans la zone de coupe du laboratoire. Inspectez le tissu et, en tenant compte de l’orientation de la couche corticale, localisez la meilleure surface pour le coller à l’étape de coupe du vibratome.
Si nécessaire, coupez la surface inégale avec le scalpel pour placer le tissu sur la scène pour une orientation optimale de la tranche. Ensuite, collez le tissu à la scène avec de l’adhésif pour tissu. Placez-le dans la chambre de tranchage et remplissez-le immédiatement d’une solution de coupe froide et bullée.
Continuez le barbotage pendant toute la procédure de coupe. Maintenant, coupez les tranches coronales ou sagittales en fonction de l’orientation tissu-lame telle que décrite dans le manuscrit. Placer les tranches dans la chambre de collecte avec une solution de coupe bouillonnante à température ambiante.
Une fois que tout le tissu a été coupé, transférer les tranches dans une boîte de Petri stérile avec une solution de rinçage à température ambiante pour éliminer l’excès de saccharose des tranches et les transporter au laboratoire de culture cellulaire. Ensuite, placez les tranches de tissu individuellement sur les inserts humides et immergés. Après 24 heures, changez le milieu pour éliminer le saccharose ou d’autres substances résiduelles restantes de la procédure de coupe.
Après deux semaines, utilisez un milieu cortical humain adulte sans gentamycine. Retirer le média de la fiole de culture cellulaire. Le septième jour de différenciation, détachez les cellules GFP-lt-NES amorcées corticalement en ajoutant 500 microlitres de trypsine et incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, ajoutez un volume égal de l’inhibiteur de la trypsine suivi de cinq millilitres de milieu DDM. Remettez les cellules en suspension, transférez doucement la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 300 G.Pendant ce temps, transférez la plaque contenant le tissu humain de l’incubateur à la hotte et retirez deux millilitres de média du haut de l’insert. À la fin de la centrifugation, retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans une matrice membranaire basale et froide et transférez la pension dans un tube plus petit.
Recueillir la suspension cellulaire dans un capillaire en verre froid relié à une tétine en caoutchouc pour l’aspiration. Injectez la suspension cellulaire sous forme de minuscules gouttes en poignardant la tranche de tissu semi-sèche à divers endroits. Laissez le gel se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, transférez la plaque de l’incubateur à la hotte et ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu cortical adulte humain au sommet de l’insert pour submerger complètement le tissu. Le tissu cortical humain aigu adulte a montré la présence de neurones, d’oligodendrocytes et d’astrocytes présentant une préservation optimale du tissu. Le tissu a montré l’expression des marqueurs neuronaux NeuN et Map2 après deux semaines de culture cellulaire.
L’enregistrement de la pince de patch cellulaire entier a montré que les neurones avaient un potentiel de membrane au repos soutenu et une résistance à l’entrée de membrane, comparables aux neurones des préparations aiguës. Les cellules étaient légèrement moins actives que dans les tissus frais, bien que la plupart des cellules aient été capables de déclencher au moins un, voire plusieurs potentiels d’action. Le tissu cortical aigu a montré l’expression des marqueurs microgliaux Iba1 et Tmem119.
Après deux semaines en culture, la microglie est devenue moins ramifiée et a acquis une morphologie plus activée que dans les tissus aigus. Quatre semaines après la transplantation ex vivo, les cellules GFP-lt-NES greffées présentaient des neurites étendus avec des arborisations étendues et complexes dans toute la culture organotypique. Presque aucune cellule greffée n’a survécu dans des tissus mal conservés.
Des débris et un marquage non spécifique des anticorps sur les cellules mortes ont été largement observés dans toute la tranche humaine. Dans le cas d’une transplantation réussie, les cellules sont devenues fonctionnellement actives et les neurones matures ont montré des potentiels d’action répétitifs et souvent spontanés. Un sodium rapide vers l’intérieur, des courants de potassium lents vers l’extérieur et un certain niveau d’activité synaptique indiquent une intégration fonctionnelle du greffon avec le tissu hôte quatre semaines après la greffe.
Plus le tissu humain est traité rapidement une fois sorti de la salle d’opération, plus la viabilité du système et le succès de la procédure expérimentale sont élevés.
