A.J.C, J.A.T et I.L reconnaissent le financement de la Commission européenne via le projet Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconnaît le financement du doctorat du China Scholarship Council (CSC, n° 201507060011). R.R reconnaît le soutien financier du programme de subventions Vidi de l’Organisation néerlandaise de la recherche scientifique (NWO Vidi 723.0160330).

L’utilisation de biofluide humain a été approuvée conformément aux directives du protocole IRB de l’Université de Leiden et de l’Université de médecine d’Innsbruck. Lorsque des biofluides humains ou animaux sont étudiés, l’approbation éthique de l’établissement de recherche est requise et a été obtenue dans le cas des résultats présentés dans le présent protocole. En outre, des rapports adéquats devraient également être effectués pour assurer la transparence et la réutilisation des données dans les travauxfuturs9,29,30.
1. Préparation des électrolytes de fond (BGE)
REMARQUE: Tous les solvants doivent être préparés dans une hotte appropriée et un équipement de protection individuelle adéquat doit être utilisé pour toutes les étapes (blous de laboratoire, gants et lunettes). À chaque étape, des flacons en plastique à faible liant sont nécessaires pour minimiser la perte d’analyte et la contamination de l’échantillon par les sels lessivés de la verrerie.
<ol><li>Préparer 10% d’acide acétique BGE (v / v), pH 2,2 sur la base quotidienne pour la métabolomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 1 mL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau désionisée (DI) à la ligne marquée et d’un mélange approfondi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 100 mM d’acide acétique, pH 2,9 par jour pour la protéomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 57 μL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau DI à la ligne marquée et d’un mélange minutieux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation du NM
<ol><li>Disperser vigoureusement les NM dans l’eau en utilisant les lignes directrices publiées31,32,33. REMARQUE: Dans le développement de ce protocole, 7 NM ont été utilisés comme suit: 100 et 1 000 nm de polystyrène carboxylé ont été utilisés pour la couronne de protéines et de métabolites, respectivement. Des NM de polystyrène non modifiés de 100 nm, des NM d’anatase TiO2 de 13 nm qui n’ont pas été modifiés ou recouverts de polymères polyacrylate ou PVP et 22 nm de NM SiO2 non modifiés ont été utilisés pour les couronnes de protéines et de métabolites. Bien que la méthode ait été développée et démontrée à l’aide de ces NM, il convient de noter que cette approche serait applicable à un large éventail de compositions, de tailles, de formes et de morphologies de NM.</li>
	<li>Caractériser la taille des particules en utilisant soit la diffusion dynamique de la lumière34,35, la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique36, l’analyse de suivi des nanoparticules37, soit la microscopie électronique à transmission et la charge de surface comme potentiel zêta à l’aide d’une taille zeta34.</li>
</ol>3. Formation de couronnes biomoléculaires
<ol><li>Diviser 2 mL de plasma humain (ou biofluide de choix) en aliquotes de 1 mL, l’une pour le métabolite et la couronne protéique et la seconde pour la caractérisation du métabolome plasmatique.</li>
	<li>Incuber 1 mg/mL de NM dans le plasma humain pendant 1 h à 37 °C tout en mélangeant doucement à 500 tr/min dans un thermomixeur. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN.</li>
	<li>Recueillir le surnageant plasmatique pour l’analyse de la couronne des métabolites. Conserver le complexe corona de la protéine NM pour la caractérisation de la couronne protéique.</li>
</ol>4. Isolement de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez le complexe NM-protéine (la pastille) dans 1 mL de tampon PBS 10x et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées. Centrifuger la solution PBS à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN, et retirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille.</li>
	<li>Resuspendez la pastille dans 1 mL de tampon de bicarbonate d’ammonium (ABC) (100 mM, pH 8,0) et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées et les sels indésirables. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN; retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape.</li>
	<li>Réduire les liaisons disulfure protéique en dissolvant la pastille de protéine NM dans 20 μL de tampon ABC (100 mM pH 8) contenant 10 mM de dithiothérapeute. Incuber la solution de réduction pendant 30 min à 56 °C.</li>
	<li>Pour digérer les protéines, ajouter 2 μg de trypsine de qualité séquençage à 20 μL d’ABC contenant 0,1% de tensioactif. Incuber la solution de digestion pendant 16 h à 37 °C.</li>
	<li>Alkyler l’échantillon par addition de 20 μL d’iodoacétamide à 55 mM dans 100 mM d’ABC et incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de 0,1 M HCl pour cliver le tensioactif et laisser agir pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Enrichir et dessaler les peptides à l’aide d’une pointe de pipette de dessalement emballée en C18.<ol>
<li>Mouiller la pointe avec 80 μL 0,1% d’acide formique 50% acétonitrile 5 fois, nettoyer avec 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois, prélever et éluer l’échantillon 10 fois, dessaler l’échantillon en rinçant 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois et éluer l’échantillon 2 fois avec 80 μL 0,1% d’acide formique 70% acétonitrile dans un tube PCR propre à faible liaison.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophiliser les échantillons et les conserver à -20 °C jusqu’à analyse.</li>
</ol>5. Isolement de la couronne métabolite
<ol><li>Prenez le plasma témoin et le surnageant de l’incubation du plasma NM de l’étape 3.3 et conservez-le sur la glace pendant la préparation de l’échantillon.</li>
	<li>Prendre 50 μL de chacun dans des flacons séparés et diluer 1 sur 10 avec de l’eau DI. Prendre 50 μL de chaque échantillon dilué et passer à de nouveaux flacons pour l’étape 5.3.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de chloroforme, 250 μL de méthanol et 350 μL d’eau DI et mélanger vigoureusement le vortex pendant 2 min. Centrifuger pendant 10 min à 20 800 x g à 4 °C.</li>
	<li>Prélever 500 μL de surnageant et filtrer à travers un filtre centrifuge de 3 kDa pendant 2 h à 10 000 x g à 4 °C. Prendre 430 μL d’ultrafiltrat et sécher dans un aspirateur rapide. Les échantillons peuvent maintenant être congelés avant l’analyse.</li>
</ol>6. Préparation du système CESI-MS38
REMARQUE: Avant l’installation des capillaires, vérifiez que l’extrémité d’entrée et de sortie des capillaires est intacte et qu’il n’y a pas de bris visibles dans le capillaire.
<ol><li>Installation d’un capillaire à revêtement neutre pour l’analyse de la couronneprotéique 39.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire à revêtement neutre (90 cm de longueur avec un diamètre intérieur de 30 μm) dans l’instrument CESI en suivant les directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse protéomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100 mM de HCl pendant 5 min à 100 psi et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer les capillaires de séparation avec BGE à 100 psi pendant 10 min, puis DI de l’eau à 100 psi pendant 30 min (cela n’est nécessaire que pour les nouveaux capillaires).</li>
		<li>Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec du BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à l’extrémité de sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M HCl, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à la SEP à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation d’un capillaire de silice fondue nue pour la caractérisation de la couronne de métabolites38.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire de silice fondue nue (90 cm de longueur avec un diamètre interne de 30 μm) dans l’instrument CESI conformément aux directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse métabolomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100% MeOH à 50 psi pendant 15 min et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à la sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M NaOH, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à l’ESI-MS à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS pour l’analyse de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez les échantillons de l’étape 4.8 dans 20 μL d’acétate d’ammonium de 50 mM pH 4.0.</li>
	<li>Effectuer une injection hydrodynamique de 5 psi 10 s de l’échantillon. Séparer à l’aide d’une tension de séparation de 30 kV avec le gradient de pression suivant: 0-10 min à 1 psi, 10-35 min à 1,5 psi et 35-45 min à 5 psi en utilisant 100 mM, pH 2,9 acide acétique comme BGE.</li>
	<li>Collectez des spectres de masse compris entre 250 et 2000 m/z avec l’acquisition de fragmentation dépendante des données du top 10.</li>
	<li>Entre les échantillons, rincer capillaire avec 0,1 M HCl pendant 3 min à 100 psi et 10 min 100 psi de BGE pour la séparation capillaire et pendant 3 min à 100 psi pour le capillaire liquide conducteur.</li>
</ol>8. CESI-MS pour l’analyse de la couronne des métabolites
REMARQUE: Tous les échantillons doivent être analysés deux fois, une fois en mode positif pour la détection des cations et une fois en mode négatif pour la détection des anions. Les échantillons de plasma témoin doivent être analysés au moins 5 fois.
<ol><li>Resuspendez les échantillons de plasma exposés et non exposés au NM de l’étape 5.4 dans 430 μL d’eau DI et vortexez vigoureusement pendant 2 min. Filtrer à travers un filtre à membrane de 0,1 μm.</li>
	<li>Prendre 95 μL de filtrat et ajouter 5 μL d’étalons internes à 200 μM pour les cations (L-méthionine sulfone) et 400 μM pour les anions (acide 2,2,4,4-D4-citrique) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 4 000 x g à 4 °C pendant 10 min avant l’analyse CESI-MS.</li>
	<li>Injecter l’échantillon hydrodynamiquement pendant 30 s (cations) et 40 s (anions) à 2 psi.</li>
	<li>Séparer les métabolites dans de l’acide acétique à 10% avec une tension de séparation de 30 kV en mode avant (cations) et inverse (anions). Le mode de séparation inverse est assisté par une pression avant de 0,5 psi sur le capillaire de séparation.</li>
	<li>Réglez le spectromètre de masse pour collecter des données en mode positif (cations) ou négatif (anions) sur la plage de masse 65-1000 m/z. Entre les échantillons, rincer les capillaires avec 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI eau et BGE à 50 psi pendant 2 min.</li>
</ol>

J.A.T est un employé d’AB Sciex UK Ltd qui participe en tant que partenaire industriel au projet ACEnano, J.A.T et tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Il s’agit de la première méthode proposée pour caractériser la couronne biomoléculaire complète incorporant des protéines et des métabolites, à partir du même échantillon, en utilisant CESI-MS. La capacité de caractériser à la fois les protéines et les métabolites à partir du même échantillon augmentera considérablement la quantité de données recueillies à partir d’une seule exposition expérimentale permettant de mieux comprendre le processus de formation de la couronne et ses impacts sur la toxicité et l’efficacité des NM en tant que nanomédicaments. De plus, CESI-MS est une plate-forme idéale pour caractériser les deux classes de biomolécules avec juste un changement de capillaire requis. À l’avenir, de nouvelles méthodes développées pour l’EC non aqueux permettront d’effectuer la lipidomique à l’aide de CE-MS40, il est donc maintenant possible d’analyser les protéines, les métabolites et les lipides à l’aide d’une seule plate-forme. Les approches conventionnelles actuelles nécessiteraient deux plates-formes LC-MS dédiées, l’une pour la couronne protéique et l’autre pour la couronne métabolite. Ainsi, cette approche peut collecter deux fois plus de données à l’aide d’une seule plateforme analytique.
Il y a quelques mises en garde à cette approche en particulier avec le métabolite corona car ce protocole propose une mesure indirecte de la couronne. En tant que tel, le problème peut survenir lorsque les niveaux de métabolites sont présents à des concentrations élevées par rapport aux NM et que la baisse subséquente de la concentration de métabolites dans la matrice est faible. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » pour isoler la couronne métabolite soit développée en raison de chaque NM ayant des chimies de surface uniques. À l’avenir, il est plus probable que des approches spécifiques à la NM pour isoler la couronne métabolite seront développées et validées; cela ne s’appliquera qu’à ce NM spécifique. Malgré cela, le CESI-MS restera une plate-forme très appropriée pour la caractérisation des métabolites chargés polaires, quelle que soit la façon dont ils sont isolés. Il convient également de noter que si une pastille ne se forme pas pendant les étapes de centrifugation conçues pour granuler les NT, une force centrifuge plus élevée peut être nécessaire; cela est plus susceptible de se produire avec des NM moins denses. Il est également essentiel que toutes les étapes de filtrage soient respectées dans le protocole en raison de l’alésage étroit des capillaires, ceux-ci peuvent facilement être bloqués si des particules n’ont pas été éliminées de manière adéquate de l’échantillon.
Alors que la couronne protéique est un domaine de recherche intense depuis un certain nombre d’années, la capacité de combiner cela avec la couronne métabolite est un nouveau domaine d’intérêt pour les scientifiques qui étudient l’interface bio-nano6,14. À ce jour, la majorité de ces études se sont concentrées sur la fraction lipidique non polaire du métabolite corona9,28. Cette méthode actuelle permet la caractérisation des métabolites hautement polaires et chargés dans la couronne, qui comprend des métabolites importants impliqués dans le métabolisme énergétique, la glycolyse et la synthèse de l’ADN. En conséquence, lorsqu’il est combiné avec le flux de travail protéomique, une caractérisation plus holistique de la couronne biomoléculaire est possible. Cela permet une analyse plus approfondie des interactions bio-nano à l’avenir. Cette méthode permet d’améliorer les connaissances mécanistes sur l’endocytose médiée par les récepteurs via les interactions des protéines et des métabolites avec les récepteurs membranaires. En outre, les interactions inter et intra corona entre les protéines et les petites molécules peuvent être explorées; par exemple, il a été récemment démontré que les protéines de la couronne jouent un rôle clé dans le recrutement des métabolites15. Il convient de noter que les résultats représentatifs de la figure 3 et de la figure 4 sont la quantification absolue des métabolites, mais une approche non ciblée utilisant une analyse de données multivariées pour comparer toutes les caractéristiques de la CE-MS chez les témoins par rapport au plasma exposé permettrait également d’élucider la liaison aux métabolites. Ainsi, il existe une marge de manœuvre importante pour étudier comment, et lesquels, les métabolites et les protéines influencent leur recrutement respectif dans les couronnes NM. Ces études supplémentaires peuvent aider à concevoir des couronnes pour optimiser l’administration de nanomédicaments ou découvrir d’autres obstacles à leur développement, tels que la suppression de l’action pharmaceutique en raison du blocage biomoléculaire de la couronne ou des fonctionnalités de ciblage du masquage.
CESI-MS avec ses débits à l’échelle nanométrique d’environ 20 nL / min et l’utilisation minimale de solvants organiques offre une amélioration des références vertes et économiques par rapport aux normes LC-MS et nanoLC-MS en termes d’utilisation de solvants, les principaux défis pour les études métabolomiques et protéomiques, respectivement. CESI-MS offre des résultats hautement reproductibles pour le temps de migration et la zone de pointe qui se comparent favorablement aux méthodes basées sur LC-MS11,15. De plus, par rapport à nanoLC-MS, le report n’est pas un problème dans CESI-MS. Par conséquent, un nettoyage approfondi du système entre les analyses d’échantillons n’est pas nécessaire, ce qui améliore considérablement le débit d’échantillon11.
En résumé, le flux de travail proposé est le premier à détailler une approche pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire complète des NM. Cela déverrouille un nouvel aspect des interactions bio-nano, la couronne métabolite, permettant ainsi la collecte de deux fois plus de données à partir du même échantillon, permettant une compréhension plus complète des interactions à l’interface bio-nano.

Les interactions bio-nano, à l’interface entre les surfaces des nanomatériaux (NM) et les matrices biologiques à partir desquelles les biomolécules s’adsorbent sur la NM, constituent un domaine de recherche intense qui sous-tend la nanosécurité et la nanomédecine1. Cette couche de biomolécules adsorbées confère une identité biologique aux NM, de sorte que les cellules les identifient comme « soi », influençant par la suite l’absorption, la distribution et les paramètres biologiques2,3,4. La grande majorité des études bio-nano se sont concentrées sur les protéines au sein de la couronne, et ont démontré que les protéines varient quantitativement et qualitativement entre les MT de compositions différentes5. Cette variation dépend à la fois des propriétés du NM telles que la taille, la fonctionnalisation et le matériau, en plus des propriétés de la matrice biologique, y compris la composition et la teneur en sel5. Un domaine d’intérêt croissant dans l’interface bio-nano sont les métabolites qui s’adsorbent en NMs6. Plusieurs études ont démontré que, comme pour les protéines, les propriétés NM sont un facteur clé dans la détermination de la composition des métabolites dans la couronne et qu’elles peuvent influencer les résultats biologiques de l’exposition nm6,7,8.
Dans les études de la couronne biomoléculaire, il existe quatre phases distinctes à sa caractérisation, la formation de la couronne, l’isolement des biomolécules au sein de la couronne, leur détection par spectrométrie de masse qualitative ou quantitative et l’identification9. À ce jour, une gamme de techniques ont été adoptées pour isoler la couronne protéique, y compris l’ébullition dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE, les extractions de solvants et de sel ou la digestion directe des protéines in situ à la surface des NM. En ce qui concerne les métabolites dans la couronne, l’isolement est plus complexe avec diverses méthodes utilisant des solvants ou même la dissolution des NM proposés comme solutions8,10,11. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » s’applique à l’isolement des métabolites des NM, en raison du large espace chimique occupé par le métabolome et de la diversité des NM possibles. Une autre approche consiste à caractériser la matrice biologique avant et après l’exposition aux NM avec la différence dans les concentrations de métabolites attribuée à l’adsorption des métabolites sur les NM.12
Cette approche alternative serait applicable à tous les biofluides et NM et bien qu’elle nécessite deux fois plus d’analyses, elle offre par conséquent une mesure beaucoup plus précise de la couronne métabolite et ne risque pas que de faibles récupérations de métabolites de la surface NM soient confondues avec une faible liaison du métabolite spécifique.
La deuxième étape de l’analyse de la couronne biomoléculaire est la détection des biomolécules. Traditionnellement pour les protéines de la couronne, cela a été la mission de nano-LC-MS, le cheval de bataille de la protéomique; d’autres approches telles queRMN 13,1D et 2D SDS-PAGE ont également été appliquées. En ce qui concerne le métabolite corona LC-MS7,GC-MS8 et la spectrométrie de masse par perfusion directe ont été utilisés14. Cependant, une nouvelle approche a récemment commencé à gagner du terrain, à savoir l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS)11,15 et a été présente dans les laboratoires NM en tant que technique autonome pour caractériser diverses propriétés physiques et chimiques des NM16. CE-MS est une technique de séparation orthogonale de nanoLC-MS et GC-MS et est capable de permettre la détection de métabolites hautement polaires et chargés17,18. De plus, le CE-MS est bien adapté à l’analyse des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et la glycosylation19,20,21,22. La dernière étape, l’identification et l’analyse des données peuvent être effectuées de plusieurs manières selon qu’une approche quantitative / qualitative ou ciblée / non ciblée est utilisée, ce qui ne relève toutefois pas du champ d’application de ce protocole.
CESI-MS, une combinaison de CE et d’une interface nanoESI, est une avancée récente dans la technologie CE utilisant une interface sans gaine. Cela permet la connexion directe de CE à très faible débit (<20 nL / min) à un spectromètre de masse à haute résolution sans dilution, ce qui améliore considérablement la sensibilité de détection23,24,25. CESI-MS permet d’analyser des échantillons à volume limité (< 10 μL) tout en maintenant une analyse très sensible26. CESI-MS se compare également favorablement aux approches nanoLC-MS traditionnelles à faible débit utilisées en protéomique et en métabolomique en termes de reproductibilité27,28, débit et de report, ce qui en fait une perspective passionnante pour la caractérisation complète de la couronne biomoléculaire.
Pour mettre en évidence le potentiel de CESI-MS pour l’analyse des interactions bio-nano, ce travail décrit la préparation de l’échantillon nécessaire pour isoler la couronne biomoléculaire NM d’un seul échantillon de plasma humain de manière à maximiser les données des aspects protéiques et métabolites de la couronne NM biomoléculaire complète. Bien que nous rendions compte de l’utilisation du plasma humain, ce protocole serait tout aussi approprié pour d’autres biofluides tels que le sérum sanguin, le milieu de culture cellulaire complet, le lysate cellulaire, le liquide céphalorachidien ou l’urine. Les analyses de ces deux composants (protéines et métabolites) seront ensuite décrites à l’aide de capillaires CESI à revêtement neutre pour la couronne protéique et de capillaires de silice fondue nue pour les métabolites cationiques et anioniques.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

L’adsorption de biomolécules des matrices biologiques environnantes à la surface des nanomatériaux (NM) pour former la couronne présente un intérêt depuis une dizaine d’années. L’intérêt pour l’interface bio-nano provient du fait que la couronne biomoléculaire confère une identité biologique aux ND et amène ainsi le corps à les identifier comme « soi ». Par exemple, des études antérieures ont démontré que les protéines de la couronne sont capables d’interagir avec les récepteurs membranaires pour influencer l’absorption cellulaire et ont établi que la couronne est responsable du trafic cellulaire des NM et de leur toxicité éventuelle. À ce jour, la plupart des recherches se sont concentrées sur la couronne protéique et ont négligé les impacts possibles des métabolites inclus dans la couronne ou les effets synergiques entre les composants de la couronne biomoléculaire complète. En tant que tel, ce travail démontre des méthodologies pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire en utilisant des approches protéomiques et métabolomiques ascendantes en parallèle. Cela comprend une digestion sur particule de la couronne protéique avec un tensioactif utilisé pour augmenter la récupération des protéines, et une caractérisation passive de la couronne métabolite en analysant les matrices des métabolites avant et après les expositions NM. Ce travail introduit l’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse (CESI-MS) comme nouvelle technique pour la caractérisation des couronnes NM. Les protocoles décrits ici démontrent comment cesI-MS peut être utilisé pour la caractérisation fiable de la couronne protéique et métabolite acquise par les NM. Le passage au CESI-MS réduit considérablement le volume d’échantillon requis (par rapport aux approches traditionnelles de chromatographie liquide – spectrométrie de masse (LC-MS)) avec des injections multiples possibles à partir d’aussi peu que 5 μL d’échantillon, ce qui le rend idéal pour les échantillons à volume limité. En outre, les conséquences environnementales de l’analyse sont réduites en ce qui concerne la LC-MS en raison des faibles débits (<20 nL/min) dans cesi-MS et de l’utilisation d’électrolytes aqueux qui éliminent le besoin de solvants organiques.

La méthode décrite est la première à caractériser à la fois les protéines et les métabolites de la couronne biomoléculaire NM en utilisant le même échantillon de plasma humain. Cette méthode est capable de détecter >200 protéines et >150 métabolites, permettant ainsi de déterminer la vue d’ensemble la plus complète de la couronne biomoléculaire complète, ce qui permet une meilleure compréhension de l’attachement, de l’absorption et des impacts cellulaires des NT.
L’utilisation de CESI-MS pour la séparation et la détection de la protéomique (Figure 1) et de la métabolomique (Figure 2) montre de bonnes fenêtres de séparation sur les deux capillaires pour chaque approche.
Cette méthode est capable de distinguer les protéines de la couronne à travers un large éventail de compositions de NMs, démontrant ainsi l’applicabilité des méthodes aux NM à travers un large éventail de caractéristiques physiques et chimiques (Tableau 1).
Les empreintes digitales uniques de la couronne métabolite peuvent également être distinguées à l’aide de la branche métabolomique de cette méthodologie (Figure 3). Bien que cette approche utilise une approche passive pour caractériser la couronne du métabolite NM, elle est toujours capable de découvrir des informations intéressantes sur le rôle des métabolites dans la couronne biomoléculaire, telles que l’adsorption différentielle des isomères(Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figure 1 : Exemple d’électrophérogramme d’une séparation corona de la protéineSiO2 à l’aide de CESI-MS après une digestion sur particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple d’électrophérogrammes ioniques extraits obtenus à partir de composés endogènes dans le plasma par CE-MS. Les composés numérotés sont les suivants: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginine; 4. Histidine; 5. Créatine; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucine; 10. Leucine; 11. Sérine; 12. Thréonine; 13. Asparagine; 14. Méthionine; 15. Glutamine; 16. Acide glutamique; 17. Phényl-D5-alanine; 18. Phénylalanine; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Méthionine sulfone (étalon interne). Publié sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès et reproduit à partir de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Analyse de la couronne protéique sur un réseau de 6 NM. Carte thermique des classes de protéines identifiées sur la silice(SiO2),le titane (TiO2), le titane coiffé de PVP (TiO2-PVP), le titane coiffé de dispex (TiO2-Dispex), le polystyrène et le polystyrène carbylé NM. Les pourcentages se réfèrent à l’abondance des protéines par rapport à la teneur totale en protéines en fonction de l’abondance des 3 principaux peptides pour chaque protéine. Compte tenu des différences observées dans les abondances relatives de protéines dans les différentes couronnes NM, il est clair que ce protocole proposé est suffisamment sensible pour différencier la couronne protéique de différents NM. Figure reproduite à partir d’une analyse CESI-MS de la couronne protéique, publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse ciblée des métabolites cationiques dans la couronne NM. Adsorption des cations enSiO2 etTiO2 NMs. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec les NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites dans la solution est le résultat de l’adsorption de métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour les NM de polystyrène. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse ciblée des métabolites anioniques dans la couronne NM en mettant l’accent sur l’adsorption des isomères. L’adsorption des anions sur une gamme de NM de titane montre des différences claires entre divers isomères tels que les phosphates de sucre. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec le NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites en solution est le résultat de l’adsorption des métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour leSiO2 et le polystyrène NMs. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Common CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyte</td>
			<td>Zone de crête RSD moyenne</td>
			<td>Temps moyen de migration RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptides intraday (n= 3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations intra-journaliers (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations inter-jours (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Reproductibilité des répliques techniques cesi-MS pour les peptides et les métabolites cationiques. DSR : écart-type relatif, comme mesure de la reproductibilité. La reproductibilité du CESI-MS en termes de zones de pointe et de temps de migration est très bonne, tous les analytes ayant une DSR moyenne <15% et des temps de migration <2,2%. Ces résultats démontrent le haut degré de confiance qui peut être attribué aux données recueillies à l’aide de cette technique et confirment que les variations détectées sont dues à de réelles différences dans la composition de l’échantillon (enrichissement en NT) plutôt qu’à des variations analytiques. Le tableau 2 est généré à partir des résultats présentés précédemment11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Nous présentons ici un protocole pour caractériser la couronne biomoléculaire complète, les protéines et les métabolites, acquis par les nanomatériaux à partir de biofluides en utilisant une approche d’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse.

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K vues.  University of Birmingham. Nous présentons ici un protocole pour caractériser la couronne biomoléculaire complète, les protéines et les métabolites, acquis par les nanomatériaux à partir de biofluides en utilisant une approche d’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse.

Vidéo: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Recherche

Biochimie

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Recherche en cancérologie

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caractérisation des protéines par chromatographie d'exclusion couplée à multi-angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Chimie

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Découvrir interactions des protéines et caractérisation de protéines de fonction utilisant la technologie HaloTag

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

Résumé

Explorer plus de vidéos

PLAYLIST