Notre protocole fournit une méthode rapide, reproductible et fiable pour générer des monocouches épithéliales intestinales primaires directes sur différentes surfaces avec un minimum de débris. Les principaux avantages de ce protocole sont une faible consommation de milieux et un entretien à faible coût de la culture cellulaire. C’est une méthode rapide pour effectuer des tests fonctionnels et des applications en aval rapides.
Ce protocole fournira la perspicacité dans l’étude de la réparation de blessure, de la barrière de perméabilité, et de la migration transepithelial de différents types de cellules. En outre, ce modèle peut être utile dans l’interaction hôte-pathogène, épithélial endommagé, et la découverte de drogue. Pour commencer, ajoutez 200 microlitres de solution de revêtement à chaque puits d’une plaque de 48 puits et d’une glissière de chambre.
Pré-incuber les deux dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Enrobez des inserts de membrane cellulaire de 0,4 micromètre avec 200 microlitres de solution de collagène. Incuber la plaque avec les inserts de membrane à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, puis la transférer dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Désinfectez une souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70%, puis disséquez le côlon du rectum au caecum à l’aide de ciseaux et de pinces. Rincer doucement les matières fécales avec du PBS glacé dans une seringue de 10 millilitres équipée d’une sonde d’alimentation de calibre 20. Retirez le côlon proximal et faites glisser doucement le côlon distal sur le tube d’alimentation de calibre 20.
Attachez le côlon à l’extrémité du tube avec un fil de suture de soie 4-0. Inversez le côlon à l’envers sur l’extrémité attachée et attachez l’autre extrémité avec du fil, puis coupez le côlon sous l’extrémité de la sonde d’alimentation à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Ouvrez doucement l’extrémité non déliée du côlon inversé sur l’extrémité d’une seringue à répétition de 1,25 millilitre à l’aide de son piston.
Faites glisser l’extrémité non liée du côlon inversé sur la seringue et attachez-la fermement avec un fil. Insérez le piston dans la seringue et gonflez le côlon jusqu’à ce qu’il ait l’air turgent sans rides visibles. Placer la saucisse du côlon gonflée dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de solution de récupération cellulaire sur de la glace pendant 20 minutes.
Gonfler et dégonfler le côlon une fois toutes les cinq minutes. Attachez le côlon gonflé sous le bout de la seringue de répétition à l’aide de fil de suture de soie 4-0. Couper la saucisse du côlon de la seringue de répétition et la placer dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’EDTA de 50 millimolaires pendant 40 minutes.
Faites pivoter le tube à quatre degrés Celsius. Remplacer la solution d’EDTA par cinq millilitres de tampon de secouage et agiter la saucisse manuellement en position verticale pendant deux minutes. Décanter la solution de secousse dans un nouveau tube de 15 millilitres et répéter l’étape de secousse jusqu’à ce qu’un total de 10 millilitres de cryptes et de tampon de secousse soit collecté.
Comptez le nombre de cryptes dans 20 microlitres de la suspension au microscope et diluez l’échantillon pour obtenir la concentration de cinq cryptes par microlitre. Centrifuger l’échantillon de la crypte à 400 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. En attendant, retirez la plaque de 48 puits et les inserts de membrane de l’incubateur et placez-les dans l’armoire de biosécurité.
Aspirer la solution de revêtement à l’aide d’une pipette P200 et laisser la plaque avec le couvercle légèrement décalé jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être plaquées. Après centrifugation de la suspension de la crypte, retirez le tampon de secousse et ressuscitez la pastille intacte dans trois millilitres de milieux complets LWRN. Ajoutez 200 microlitres de cryptes à chaque puits de la plaque pré-revêtue de 48 puits et de la lame de chambre et incuber les deux dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, aspirez les médias et ajoutez de nouveaux médias. Généralement, les cellules deviennent confluentes en 24 à 48 heures. Pour les inserts de membrane de culture cellulaire, ajoutez 200 microlitres de cryptes au sommet des inserts et 600 microlitres de milieux LWRN complets au bas.
Le lendemain, aspirez les médias et ajoutez de nouveaux médias uniquement à la chambre haute. Incuber la plaque dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Mesurer la résistance électrique transépithéliale tous les jours à l’aide d’un volt/ohmmètre épithélial.
Après l’isolement des cryptes d’un côlon murin et la vérification de la concentration, la suspension de crypte a été concentrée à cinq cryptes par microliter. Des puits de plaque de 48 puits ont été soumis à une analyse de blessure d’égratignure en atteignant la confluence de cellules. Après 24 heures, on a observé la réparation de blessure indiquant que la culture était saine et viable.
Des valeurs de niveau plus élevées ont été atteintes lorsque les médias sont passés du LWRN au média de différenciation. En outre, une diminution des marqueurs ISC et une augmentation des marqueurs de différenciation ont été observées indiquant que les monocouches différenciées ont été générées avec succès. En outre, l’aspect des sous-types de cellules épithéliales différenciées cultivées dans différentes conditions a été montré par immunofluorescence.
En essayant ce protocole, il est important de s’assurer que le côlon n’est rompu à aucun moment pendant la préparation et reste gonflé pour libérer des cryptes dans une préparation extrêmement propre. Une fois que les 2d monocouches de cellules épithéliales intestinales se forment, nous pouvons effectuer des tests d’immunofluorescence, de grattage et de perméabilité et d’autres applications en aval. Cela fournira des connaissances sur la cicatrisation des plaies, la migration de différents types de cellules et les études épithéliales sur la réparation et les dommages.
