Le protocole présenté est utilisé pour le criblage à haut débit et l’identification de nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs électrogéniques reconstitués dans les protéoliposomes ou présents dans les vésicules membranaires. La conception de tests de transfert peut être difficile dans plusieurs cas, surtout si les substrats étiquetés ne sont pas disponibles. Si la même électrophysiologie permet d’étudier l’effet des nanocorps sur le transport de pratiquement tous les transporteurs électrogéniques, puisque l’électrophysiologie SSM ne nécessite pas de substrats marqués.
Les nanocorps ont été étudiés pour leur utilisation dans des applications médicales. Cette technique peut aider à dépister les inhibiteurs potentiels ciblant des transporteurs électrogéniques spécifiques d’humains ou d’agents pathogènes humains. Pour commencer, prenez 10 tubes propres et transférez 10 millilitres de tampon à membrane solide non active, ou SSM, dans chaque tube.
Pour préparer les tampons SSM activateurs, ajoutez le substrat dans les tubes en utilisant une série de concentrations autour de la demi-concentration maximale attendue. Démarrez le logiciel SSM et laissez la machine s’initialiser automatiquement. Définissez le chemin d’enregistrement des données.
Confirmez en appuyant sur le bouton OK. Sélectionnez le protocole de nettoyage initial standard dans les options de flux de travail et cliquez sur Exécuter. Ensuite, montez la puce recouverte de protéoliposome sur la douille.
Déplacez le bras pour verrouiller la puce. Entourez la puce montée avec le capuchon. Sélectionnez le programme CapCom dans le flux de travail et laissez-le s’exécuter pour déterminer la conductivité et la capacité.
Confirmez que la conductivité est inférieure à cinq nanosiemens et que la capacité est comprise entre 15 et 35 nanofarad avant de l’utiliser pour la mesure. Transférez les solutions d’activation dans des flacons et positionnez les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non actif dans un réservoir et placez-le à côté du porte-puce à la position du réservoir à droite.
Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solution non active, activée et non active, ou d’une séquence BAB, dans une boucle qui effectue trois mesures et passe au tampon d’activation suivant pour les 10 tampons. Utilisez le débit par défaut de 200 microlitres par seconde avec un temps d’écoulement d’une seconde, d’une seconde et d’une seconde pour la séquence BAB et cliquez sur lecture pour démarrer la mesure. Enregistrez le protocole et laissez le flux de travail s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture.
Effectuez ensuite la même expérience en utilisant des liposomes sans protéines. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données pour tracer le courant mesuré par rapport au temps et utilisez la fonction pour l’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Tracer le courant de crête par rapport à la concentration du substrat pour déterminer le demi-effet maximal de la concentration, ou CE50, du substrat via une régression non linéaire.
Transférer 50 millilitres du tampon SSM non actif dans un tube propre. Ajouter le substrat choline à une concentration finale de cinq millimolaires et l’utiliser pour une mesure de contrôle positif. Transférez 10 millilitres du tampon SSM non activateur dans un tube propre.
Ajouter la choline de substrat à cinq millimolaires et le nanocorps à la concentration finale de 500 nanomolaires. Répétez l’étape pour chaque nanocorps afin de préparer les solutions d’activation comme illustré. Démarrez la machine SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposomes, comme démontré précédemment.
Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez le tampon dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non actif sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le dans l’échantillonneur de sonde. Répétez ensuite ce processus pour toutes les solutions contenant des nanocorps avec une solution activatrice et non active.
Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence BAB. Créez une boucle qui effectue trois mesures de la séquence BAB à l’aide de tampons sans nanocorps, deux mesures de la séquence BAB avec des tampons contenant un nanocorps, une incubation de 120 secondes avec le nanocorps et trois mesures de la séquence BAB avec des tampons contenant le nanocorps. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture.
Ensuite, créez un nouveau protocole pour le flux de travail en utilisant une séquence BAB et une boucle de cinq mesures pour laver le corps nano lié de manière réversible. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton de lecture. Comparez le dernier courant de crête des mesures avec la mesure initiale du substrat uniquement.
Si le courant de crête atteint la valeur initiale, le nanocorps a été lavé avec succès et les conditions initiales ont été rétablies. Sinon, répétez le flux de travail ou passez à une nouvelle puce. Répétez ce processus en utilisant des puces individuelles pour chaque écran de nanocorps, ou répétez avec plusieurs nanocorps utilisant la même puce.
Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données afin de tracer le courant mesuré par rapport au temps. Ensuite, le logiciel sélectionne automatiquement la fonction d’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Normalisez le courant de crête et la présence du nanocorps en fonction de la mesure du substrat en cours.
Tracez les courants de crête dans l’histogramme et comparez les courants de crête des mesures de substrat uniquement aux courants de crête mesurés en présence de nanocorps pour identifier les nanocorps inhibiteurs. Transférer 50 millilitres du tampon SSM non actif dans un tube propre et ajouter la choline de substrat à une concentration finale de cinq millimolaires, et l’utiliser comme solution activatrice pour le contrôle positif. Ajouter cinq millilitres de la solution non active à huit tubes propres, puis ajouter de la choline de substrat et du nanocorps inhibiteur aux tubes à des concentrations dans la plage IC50 attendue.
Ajouter 10 millilitres de la solution non active aux huit tubes et ajouter un nanocorps inhibiteur à chaque tube correspondant au tampon de non-activation. Démarrez la configuration SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposome. Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez-la dans l’échantillonneur de sonde.
Ensuite, transférez le tampon non actif sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le à la position du réservoir à côté du porte-puce à droite. Transférer les solutions activatrices et non actives contenant des nanocorps dans des flacons et positionner les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence BAB.
Inclure une boucle pour mesurer chaque concentration deux fois, incuber pendant 120 secondes et mesurer trois fois de plus. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données pour tracer le courant mesuré par rapport au temps et sélectionnez la fonction pour l’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation. Tracer les courants de crête par rapport à la concentration de nanocorps pour déterminer la CI50 via une régression non linéaire.
Pour déterminer la concentration du substrat à utiliser lors d’un criblage de nanocorps, le transport électrogénique a été mesuré sous différentes concentrations de substrat pour déterminer la CE50. Une concentration de substrat correspondant à des conditions saturantes, cinq millimolaires, a été sélectionnée et maintenue constante dans tous les tampons d’activation. L’effet des nanocorps inhibiteurs sur le transport électrogénique a été visualisé à partir de la diminution des amplitudes des courants de crête.
Après avoir exécuté le protocole de lavage pour permettre le déliaison des nanocorps, une récupération de 80 à 95% de l’amplitude initiale du courant de crête a été observée. Lors du passage de conditions non actives à des conditions d’activation, aucun courant d’artefact significatif n’a été introduit par les nanocorps présents dans ces tampons. Après avoir sélectionné des nanocorps ayant des propriétés inhibitrices, les valeurs IC50 pour les nanocorps individuels ont été déterminées.
Il est crucial de donner suffisamment de temps pour l’étalonnage des protéoliposomes sur la puce avec le tampon contenant le nanocorps. Étant donné que la liaison est réversible, le nanocorps doit être présent dans les tampons activateurs et non activateurs.
