La technique permet d’étudier la fonction et la gamme des molécules de signalisation au cours de l’embryogenèse en transplantant des sources de signalisation ectopiques. Il facilite également la génération efficace de mutants de la lignée germinale. Le protocole peut être appliqué aux embryons de poisson-zèbre et de medaka au stade blastula, et probablement aussi à d’autres stades embryonnaires et à des espèces de TDO.
Pour assembler le dispositif de transplantation, connectez une seringue étanche au gaz à pointe de leurre de 25 microlitres à un porte-pipette à l’aide du raccord de verrouillage du leurre. Ensuite, montez l’appareil directement sur un micro-manipulateur manuel. Pour utiliser le dispositif de transplantation, placez le micro-manipulateur avec le dispositif assemblé à côté d’un stéréomicroscope.
Retirez ensuite le piston et insérez l’aiguille de transplantation. Abaissez l’aiguille dans un plat rempli de solution de Ringer à un angle de 45 degrés jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit immergée. Insérez le piston environ à mi-chemin pour rincer les solutions du Ringer, en ne laissant qu’un petit volume d’eau dans la fine partie effilée de l’aiguille.
Lorsque vous utilisez une aiguille de transplantation pour la première fois, enduisez l’intérieur de l’aiguille en tirant le joug d’un embryon sacrifié et en expulsant complètement le matériau du joug. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de transplantation, positionnez doucement l’embryon donneur, puis positionnez l’ouverture orthogonale de l’aiguille à la surface de l’embryon et tirez soigneusement le piston pour attirer les cellules dans l’aiguille. Une fois que le nombre souhaité de cellules est aspiré, arrêtez l’aspiration en poussant doucement le piston vers le bas et retirez l’aiguille de l’embryon en secouant l’aiguille sur le côté dans un mouvement court et rapide.
Laissez une solution de Ringer de chaque côté de la colonne cellulaire en limitant les cellules à l’extrémité effilée de l’aiguille. Éliminez tout jaune ou débris cellulaire restant en déplaçant lentement le piston de haut en bas et en lavant les cellules avec la solution de Ringer. Ensuite, déplacez le plat de transplantation avec la main non dominante pour positionner l’aiguille orthogonale à la surface de l’embryon hôte.
Appliquez une légère pression sur l’embryon en le pressant soigneusement contre les parois. Ensuite, avec un mouvement rapide et net, percez la couche enveloppante de l’embryon hôte en prenant soin de ne pas gratter le jaune avec l’aiguille. Une fois l’aiguille à l’intérieur, poussez doucement le piston pour extruder la colonne de cellules dans l’embryon et rétractez lentement l’aiguille simultanément.
Pour la transplantation de cellules germinales, remplissez une boîte de transplantation avec la solution de Ringer, puis transférez la sphère déschorionée aux embryons au stade du dôme dans la boîte de transplantation et positionnez les embryons hôtes et donneurs dans des colonnes alternées pour transplanter les cellules d’un embryon donneur à six embryons hôtes différents. Pour effectuer la transplantation, orientez les embryons avec la marge vers l’aiguille de transplantation. Pour la transplantation germinale, prélevez les cellules sources de la marge et déposez-les au même endroit dans l’embryon hôte.
Une fois la transplantation terminée, laissez l’embryon récupérer dans la solution de Ringer pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence, examinez les cellules transplantées. Ensuite, transférez les embryons dans une plaque enduite d’agarose de 24 puits avec un milieu embryonnaire regroupant tous les embryons hôtes qui ont reçu des cellules du même donneur dans le même puits.
Ensuite, incubez les embryons à 28 degrés Celsius jusqu’au lendemain. Si nécessaire, transférez les embryons du donneur dans des bandelettes PCR étiquetées pour le génotypage. 30 heures après la fécondation, dépister les embryons hôtes pour des greffes germinales réussies sous un stéréomicroscope à fluorescence.
Les cellules germinales doivent être présentes au niveau de la rainure au-dessus de l’extension du jaune. Cultiver la larve transplantée avec succès sur le capuchon adulte selon les conditions d’élevage standard. Dans les transplantations réussies, l’embryon semble normal et similaire en forme et en clarté du jaune aux embryons non transplantés sans grandes déchirures dans le blastoderme.
En revanche, si un embryon est visiblement endommagé pendant la transplantation, il ne se développera pas normalement. Bien que le dispositif de transplantation ait été principalement utilisé sur des embryons de poisson zèbre au stade de blastula, la transplantation et l’extirpation cellulaire peuvent également être effectuées dans des embryons de stade de blastula décononnés du poisson de riz japonais medaka. Dans le cas spécifique de la transplantation germinale, une bonne transplantation aboutit à un embryon avec une longue colonne horizontale de cellules directement au-dessus de la marge du jaune.
Cependant, le succès de la procédure ne peut être évalué qu’après 24 à 30 heures de fécondation lorsque les cellules germinales sont distinctes dans leur fluorescence des cellules somatiques. Les cellules germinales primordiales apparaîtront sous forme de petites sphères fluorescentes dans le sillon directement au-dessus de l’extension du jaune. La présence de ces cellules germinales au bon endroit indique une transplantation germinale réussie.
Des exemples de transplantations infructueuses sont présentés ici. Dans le premier exemple, bien que les cellules germinales aient atteint le mésoderme gonadique, car l’embryon hôte est gravement déformé, il ne se développera pas normalement. Dans le deuxième exemple, les cellules fluorescentes ne sont détectées qu’à l’extérieur du sillon.
Ces cellules sont soit des cellules somatiques, soit des cellules germinales qui n’ont pas migré correctement. Et les deux types de cellules ne contribueront pas à la lignée germinale de l’embryon. Il est essentiel d’éviter d’endommager les cellules transplantées et l’embryon hôte.
Les cellules doivent être dressées lentement, éliminées de tout jaune restant et être insérées avec soin. Cette méthode fournit un moyen facile de transplanter des cellules dans des embryons de poisson zèbre et sera utile pour générer des sources ectopiques et des mutants germinaux. Le principal avantage de cet appareil, il est peu coûteux, et est beaucoup et utilise.
