L’importance de notre méthode réside dans sa capacité à répondre à la question, quelles sont les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires, les fibres qui suspendent le cristallin à l’intérieur de l’œil? Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet de quantifier les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires petites et délicates de souris avec et sans modifications génétiques ciblées. Des mutations dans les gènes codant pour des protéines de microfibrilles sous-tendent plusieurs conditions syndromiques héréditaires.
En utilisant notre technique, nous pouvons étudier comment des mutations spécifiques modifient les propriétés biomécaniques des microfibrilles. Pour commencer, après l’euthanasie de la souris, retirez les yeux à l’aide de pinces fines. Insérez la pointe d’une aiguille de fixation à travers la paroi de l’œil et positionnez-la au centre de l’humeur vitrée, en prenant soin de ne pas endommager la lentille.
Transférer soigneusement l’œil empalé dans un tube rempli de 4% de paraformaldéhyde et de solution saline tamponnée au phosphate. Ouvrez la vanne reliant l’aiguille à un réservoir fixé situé à 25 centimètres au-dessus de l’échantillon qui maintient une pression positive équivalente à 15 à 20 millimètres de mercure dans l’œil pendant la période de fixation et laissez l’échantillon se fixer pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’aiguille de fixation et lavez l’œil pendant 10 minutes dans une solution saline tamponnée au phosphate.
En utilisant des ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et un stéréomicroscope, faites une incision de pleine épaisseur dans la paroi de l’œil près de la tête du nerf optique. Étendez la coupe vers l’avant vers l’équateur, puis autour de la circonférence équatoriale de l’œil tout en épargnant soigneusement les processus ciliaires délicats et les fibres zonulaires associées. Exposez la surface postérieure de la lentille en retirant l’arrière du globe.
Retirez l’œil disséqué de la solution tampon à l’aide d’une pince et placez-le sur une lingette sèche avec la cornée tournée vers le bas. Faites glisser doucement la cornée sur la surface de la lingette pour la sécher. Appliquez une goutte de colle instantanée au fond d’une boîte de Petri de 50 millimètres et fixez-y la plate-forme.
Placez le plat sur la plaque de scène du stéréomicroscope afin que le puits avec la colle soit en vue. Pour accueillir l’œil dans les puits de la plate-forme de la boîte de Pétri, ajoutez trois microlitres de colle instantanée. Placez-le soigneusement dans le puits et ajustez-le rapidement de sorte que l’arrière de la lentille soit orienté vers le haut.
Séchez le côté exposé de la lentille en épongeant doucement avec le coin d’une lingette sèche. Pour mesurer la réponse viscoélastique zozonulaire, allumez la balance, placez la boîte de Petri sur la balance, puis démarrez le programme d’enregistrement de la balance et le logiciel de la caméra. Allumez le contrôleur du servomoteur.
Démarrez l’application du contrôleur sur l’ordinateur et définissez les paramètres de mouvement par incréments de 50 micromètres. Créez une courbure de 90 degrés dans une tige capillaire. Glissez le capillaire plié dans le porte-sonde capillaire et serrez les vis de fixation.
À la pointe capillaire, ajoutez une petite perle de colle de durcissement UV. Déplacez l’extrémité de la sonde capillaire à l’aide des réglages manuels du manipulateur et placez-la directement sur le dessus de l’objectif. Grâce à l’inspection visuelle frontale et à la vue latérale à l’aide d’une caméra de microscope, examinez que la partie inférieure de la colle UV semble centrée sur le dessus de l’objectif.
En regardant à travers l’appareil photo, abaissez la pointe de la sonde jusqu’à ce que la colle UV entre en contact avec l’objectif et couvre 1/3 à 1/2 de sa surface supérieure. Durcissez la colle à l’aide d’une source de lumière UV directionnelle presque visible de 380 à 400 nanomètres de longueur d’onde et d’une intensité d’environ un milliwatt. Ajouter la solution de PBS à la boîte de Petri jusqu’à ce que l’œil soit recouvert à une profondeur d’au moins deux millimètres.
Placez une lentille cylindrique devant le microscope et de près de la boîte de Pétri sans la toucher. Dans le même temps, démarrez la journalisation dans un programme de minuterie. Prenez une photo de l’œil et de la sonde à l’aide de l’appareil photo.
Après 60 secondes, commencez un déplacement de 50 micromètres. Répétez toutes les 60 secondes jusqu’à ce que l’expérience soit terminée comme indiqué par la rupture de toutes les fibres zonulaires. Enregistrez les données de journalisation de l’échelle à la fin d’une exécution et exportez-les dans un format de feuille de calcul compatible.
Enregistrez également les images de l’objectif obtenues pendant la course. Importez les données dans une feuille de calcul. À l’aide de la première et de la dernière échelle, interpolez la dérive de la lecture d’arrière-plan au fil du temps due à l’évaporation, puis soustrayez l’arrière-plan interpolé de la lecture à chaque point temporel.
Après avoir effectué le test et corrigé l’évaporation, le graphique des données viscoélastiques est inversé. L’ampleur des forces instantanées et détendues augmente à chaque pas jusqu’à environ 1 000 secondes, puis diminue à mesure que les fibres zonulaires commencent à se briser jusqu’à ce que le point de temps de 1 500 secondes soit atteint lorsque toutes les fibres sont brisées. Pour cette démonstration, la réponse viscoélastique pour les souris de type sauvage et les souris déficientes en MAGP-1 a également été comparée.
Au temps initial de zéro à 600 secondes, les graphiques se ressemblent suggérant que les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires n’ont pas été modifiées de manière significative. Cependant, chez la souris knockout MAGP-1, les fibres se cassent prématurément. Les forces de rupture des fibres zonulaires ont été obtenues avec la méthode pull-up pour MAGP-1 par rapport aux souris de type sauvage à un mois et un an.
Les résultats ont indiqué que la force des fibres augmente avec l’âge pour les souris de type sauvage. Tout contact accidentel avec la boîte de Petri au cours de ces étapes peut provoquer un déplacement de la paroi oculaire par rapport au cristallin, endommageant potentiellement les fibres zonulaires. Ce test de traction aide à identifier les protéines qui contribuent à la résistance à la traction des microfibrilles.
Nous utiliserons ces informations pour construire des modèles plus réalistes de l’intérieur des fibres zonulaires.
