Le protocole décrit comment enregistrer un profil de mobilité ionique pour les fragments produits lors de l’activation d’une molécule dans le spectromètre de masse, et faire la distinction entre les structures isomériques. Le protocole permet aux glycanes d’être classés en 11 groupes en ce qui concerne certaines de leurs caractéristiques structurelles clés, et ainsi de fournir une information qui est autrement difficile à obtenir. Il peut servir à construire des réseaux moléculaires extrêmement génériques et adaptés à de nombreuses familles moléculaires, telles que les métabolites ou les médicaments d’intérêt dans de nombreux domaines de recherche.
L’approche tire le meilleur parti d’un nouveau concept en spectrométrie de mobilité ionique et sera utile lorsque la spectrométrie de masse seule ne parviendra pas à discriminer entre deux structures. L’expérience nécessite une bonne maîtrise de la spectrométrie de masse et de la mobilité ionique. Cependant, l’expérimentateur devrait réussir à mettre en œuvre la méthode si l’on suit attentivement chacune des étapes.
Simon Ollivier, un doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, configurez une séquence IMS à passage unique à partir de la page Tune, mettez l’instrument en mode Mobilité et ouvrez la fenêtre Contrôle de séquence cyclique. Sélectionnez Mode avancé dans l’onglet Fonctions cycliques de cette nouvelle fenêtre, sélectionnez Ajouter un bundle, puis Single/Multipass.
Attendez qu’une séquence d’événements de mobilité apparaisse dans l’onglet Séquence de la même fenêtre. Adaptez la séquence pour que tous les ions calibrants fassent un seul passage autour de la piste de course IMS cyclique. Ne modifiez pas le temps d’injection ou le temps d’éjection et d’acquisition, cependant, réduisez le temps de séparation à une milliseconde.
Si certains ions du mélange d’étalonnage ne rentrent pas dans la fenêtre d’heure d’arrivée affichée, modifiez la synchronisation de l’IMS avec le poussoir de l’analyseur TOF d’accélération orthogonale en augmentant le nombre de poussées par bac dans l’onglet Paramètres ADC. Pour enregistrer une acquisition de deux minutes dans la fenêtre Contrôle de séquence cyclique, cliquez sur Acquérir pour ouvrir la fenêtre contextuelle Paramètres d’acquisition, entrez le nom de fichier, la description et la durée de l’acquisition, minutes, puis cliquez sur Enregistrer. Basculez l’instrument en mode TOF à partir de la page MS Tune pour vérifier la stabilité du signal.
Enregistrez une acquisition complète de l’échantillon par SEP pendant une minute, ce qui sera utile pour vérifier le profil isotopique et la présence de contaminants potentiels. Mettez l’instrument en mode MSMS à partir de l’onglet Profil Quad/MS de la page tune principale. Sélectionnez la masse du fer ciblé dans le champ MSMS Mass pour l’isolation dans le quadripôle.
Enregistrez une acquisition d’une minute pour vérifier l’isolement du précurseur lors du traitement des données. Pour effectuer une sélection basée sur la mobilité de l’isomère d’intérêt, basculez l’instrument en mode Mobilité dans la fenêtre Contrôle de séquence cyclique, dans l’onglet Fonctions cycliques, sélectionnez Ajouter un faisceau, puis Découpage. Attendez qu’une séquence complexe d’événements de mobilité apparaisse dans l’onglet Séquence.
Positionnez l’événement Eject and Acquire juste après le premier événement Separate, puis cliquez sur Exécuter. Recherchez les résultats de la séparation initiale à afficher en temps réel. Augmentez la durée du premier événement Separate pour une séparation multipasse en modifiant la valeur temporelle de cet événement dans la séquence jusqu’à ce que la résolution des pics IMS soit satisfaisante.
Enregistrez une acquisition d’une minute pour référence. Cliquez sur Pause, positionnez l’événement Éjecter et acquérir sous les événements Éjecter, Éjecter vers le pré-magasin et Maintenir et éjecter. Ajustez la durée des événements de sorte que le pic ciblé se trouve dans la région Éjecter vers le pré-stockage et que tout autre ion se trouve dans la région Éjecter ou Tenir et éjecter.
Positionnez l’événement Eject and Acquire à la fin de la séquence sous les événements Reinject from Pre-Store et les deuxièmes événements Separate. Cliquez sur Exécuter pour afficher la population sélectionnée. Vérifiez la qualité de l’isolement.
Enregistrez une acquisition d’une minute pour référence. Dans l’onglet Séquence, dans la colonne en regard des heures d’événement définies par l’utilisateur, recherchez les heures résumées de tous les événements. Prenez note de l’abs temporel trouvé sur la ligne de l’événement Reinject from Pre-Store pour effectuer l’étalonnage CCS.
Définissez la durée de l’événement Separate procédant directement à l’éjection et à l’acquisition à une milliseconde. Sur la ligne Réinjecter à partir du pré-magasin, cochez la case Activer l’activation et optimisez la fragmentation avec le contrôle intégré. Si la fragmentation n’est pas satisfaisante avec le contrôle intégré, décochez la case Activer l’activation et procédez à l’optimisation manuelle des tensions de réinjection, augmentez le gradient de pré-matrice et abaissez la tension de décalage de la matrice jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants.
Pour enregistrer une acquisition de deux minutes dans la fenêtre contextuelle Acquisition, cochez l’option Conserver le temps de dérive pour générer un fichier contenant uniquement les heures d’arrivée, par opposition à M sur Z étiqueté comme _dt.raw. Après avoir effectué l’analyse MS du mélange de pentasaccharides arabinoxylane, le spectre a montré un motif isotopique avec un seul pic à M sur Z 685,24 suggérant que les deux composés sont de nature isomérique. Les adduits des pentasaccharides ont été séparés par la cellule IMS cyclique, et trois pics ont été séparés avec des heures d’arrivée différentes.
Le XA3XX pur affiche les pics à 83 et 90 millisecondes, tandis que le XA2XX présente un pic à 94 millisecondes. Après la première étape de la séparation IMS, les ions appartenant à XA3XX ont été éjectés et le pic à 94 millisecondes a été sélectionné pour l’analyse IMS-IMS. Une séparation à trois passages a été effectuée après réinjection de l’ion sans activation, et un pic pour XA2XX a été obtenu à 199 millisecondes.
Les données IMS-IMS MS générées ont été déconcentrées en utilisant l’heure d’arrivée et les dimensions M sur Z, générant les spectres IMS-IMS. Les pics supérieurs à 0,2 % d’intensité relative ont été exportés pour l’étalonnage du CSC, ce qui a donné un spectre IMS-IMS étalonné au CSC centroïde. Il est toujours important de vérifier l’isolement de l’ion précurseur, sinon, le spectre peut provenir d’un mélange du composé d’intérêt et des contaminants.
Nous utilisions auparavant les spectres IMS-IMS pour construire des réseaux et classer des composés, mais ils pouvaient également être utilisés pour rechercher dans des bases de données des identifications de composés. Cette technique est très récente, mais nous nous attendons à ce qu’elle soit extrêmement utile en glycomique ainsi que dans tout contexte où les analystes sont confrontés à des molécules isomériques.
