Cette nouvelle technique combine la spectrométrie de masse de mobilité ionique avec la modélisation moléculaire et la théorie de la dynamique des réactions pour déterminer la thermochimie relative de deux réactions de dissociation concurrentes d’un complexe ternaire. La combinaison de ces techniques caractérise les voies de réaction des réactifs et des produits, les structures conformationnelles et l’affinité du ligand pour former un complexe ternaire avec l’ion métallique. Cette recherche modélise la réactivité de deux marqueurs peptidiques potentiels pour la purification de protéines recombinantes, où le marqueur réagit avec le métal chélaté par l’acide nitrilotriacétique dans une colonne d’affinité métallique immobilisée.
Commencez par charger l’échantillon de 2 millilitres dans une seringue nasale émoussée de 2,5 millilitres et injectez l’échantillon dans l’électrospray de l’instrument à l’aide de la pompe à seringue de l’instrument à un débit de 10 microlitres par minute. Placez l’instrument en mode mobilité ionique négative ou IM-MS. Identifiez le profil isotopique masse-charge du complexe ternaire alternatif de liaison aux métaux chargé négativement, ou complexe amb-métal-NTA, en ouvrant le programme de spectrométrie de masse et en sélectionnant Spectre.
Ensuite, sélectionnez Outils puis Modèle isotopique. Dans la fenêtre contextuelle, listez la formule moléculaire du complexe, cochez la case Show Charged Ion, entrez 1 pour la charge de négatif et cliquez sur OK.In le motif isotopique affiché du complexe, notez le pic de masse le plus bas. Dans le logiciel de l’instrument, sélectionnez Configuration puis Profil quadruple.
Ensuite, sélectionnez Fixe manuel et entrez la masse du pic isotopique le plus bas. Cliquez sur Mettre à jour et fermez la fenêtre. Encore une fois, sélectionnez Configuration, puis cliquez sur Résolution de Quad.
Collectez les spectres IM-MS d’ions négatifs en commençant par la première énergie de collision de transfert en utilisant une durée de 5 minutes et un temps de balayage de 2 secondes. Répétez l’opération pour recueillir les spectres IM-MS pour chacune des autres énergies de collision. Utiliser les distributions intégrées du temps d’arrivée, ou zones ATD, pour le complexe ternaire amb-métal-NTA et deux produits, le complexe NTA-métal et le complexe amb-métal, pour normaliser à une échelle de pourcentage relative.
À partir des mesures de dissociation induite par collision à seuil répliqué, ou TCID, trouvez la moyenne et les écarts-types de chaque point de données. Ensuite, convertissez l’énergie de collision de transfert de châssis de laboratoire en énergie de collision du centre de masse. Pour mesurer les sections efficaces de collision, prélever les spectres IM-MS d’ions négatifs de l’échantillon de poly-DL-alanine de 10 ppm, ou PA, pendant 10 minutes en utilisant les conditions de fonctionnement instrumentales.
Ensuite, collectez les spectres IM-MS de chaque complexe ternaire pendant 5 minutes. Extrayez l’ATD de chacun des complexes PA et ternaires et exportez leurs fichiers vers le logiciel de spectrométrie de masse à l’aide de l’option Retain Drift Time. Trouvez les temps d’arrivée moyens à partir des maxima des courbes ATD correspondantes.
Utiliser une méthode d’étalonnage en coupe transversale pour convertir les temps d’arrivée moyens en sections transversales de collision du complexe ternaire. Dans le menu principal CRUNCH, ouvrez le fichier texte GB5 contenant l’énergie du centre de masse ou les intensités relatives dépendantes de l’ECM des produits. Répondez Non pour lire les paramètres.
Ensuite, sélectionnez Modélisation suivi de Définir tous les paramètres. Dans les options du modèle de réaction, choisissez l’option CID seuil par défaut suivie de RRKM avec intégration sur la distribution de transfert d’énergie du complexe ternaire. Entrez 2 pour les canaux de produits indépendants modélisés, puis sélectionnez Calculer les coupes.
Pour le type de modèle non alambiqué, choisissez une section efficace de 0 Kelvin, qui inclut la correction statistique RRKM des décalages cinétiques dus à la fenêtre temporelle de 50 microsecondes entre la cellule de collision et le détecteur de temps de vol. Pour les options de convolution, choisissez la double intégrale de Tiernan, qui inclut la convolution sur les distributions d’énergie translationnelle entre l’ion complexe ternaire et le gaz de collision argon. Pour la méthode d’intégration numérique, choisissez la quadrature gaussienne avec des sections transversales préenregistrées.
Parmi les options de saisie des paramètres moléculaires, entrez G pour lire le fichier de modélisation structurelle avec les fréquences vibrationnelles et rotationnelles PM6 du complexe ternaire. Réponse Oui à la question :L’un des réactifs est-il atomique ? Écrivez l’emplacement et le nom du fichier de modélisation.
Entrez 1 pour la charge sur ion et 1,664 pour la polarisabilité du gaz argon. La masse d’ion et la masse de la cible sont respectivement pour le complexe ternaire et l’argon et sont automatiquement lues à partir du fichier texte GB5. Entrez 0 pour les vibrations harmoniques.
Appuyez sur Entrée pour lire les constantes de rotation 1D et 2D du fichier de modélisation structurelle. Sélectionnez les valeurs par défaut de 0 pour les traitements de rotor entravé et de 1 pour la symétrie moléculaire. Choisissez la température par défaut de 300 Kelvin pour le réactif.
Sélectionnez Intégration pour la méthode de réduction de la densité du tableau d’états. Sélectionnez Oui pour tronquer la distribution d’énergie. Entrez le numéro d’onde 40000 pour l’énergie maximale pour la distribution, le numéro d’onde 2 pour la taille du bac et 32 pour le nombre de points dans la distribution d’énergie.
Pour les paramètres du modèle TCID/RRKM, choisissez Oui pour Modifier, entrez 0 pour Temps fixe et 0,000050 secondes pour la limite supérieure de la fenêtre de détection. Pour le canal de produit 1, sélectionnez 1 pour un seul état de transition parmi les options de canal de dissociation et 0 pour aucune dissociation séquentielle. Pour le type d’état de transition, choisissez 1 pour orbite.
Sélectionnez G pour lire les fichiers programme de modélisation qui contiennent les paramètres de rotation et vibratoires PM6 pour le complexe amb-métal plus les produits NTA. Entrez No for :L’une des espèces de transition de l’état de transition de limite d’espace de phase, ou PSL TS, est-elle atomique ? Entrez l’emplacement et le nom du fichier amb-metal complex.
Utilisez 1,062 pour les fréquences d’échelle, appuyez sur Entrée pour le nombre d’atomes et entrez Non pour:La molécule est-elle linéaire? Répétez la même chose pour le fichier de modélisation qui contient les fréquences vibratoires et rotationnelles du produit NTA. Entrez la description du TS en orbite. Entrez 1.0 pour la charge de l’ion amb-métal, puis entrez la polarisabilité et le moment dipolaire de NTA.
Sélectionnez 0 Kelvin pour la température de rotation et dipôle verrouillé pour le traitement de l’état de transition orbitale. Entrez les masses moyennes de l’ion amb-métal et du NTA. Appuyez sur Entrée pour lire les constantes de rotation 1D et 2D des fichiers de modélisation.
Sélectionnez 0 pour les rotors entravés, 1 pour la symétrie moléculaire et 1 pour la dégénérescence réactionnelle. Entrez l’option Aucune modification. Pour le canal de produit 2, sélectionnez 1 pour l’état de transition unique, 0 pour aucun pour la dissociation séquentielle et 1 pour l’orbite pour le type d’état de transition.
Sélectionnez G pour lire les fichiers de modélisation qui contiennent les paramètres de rotation et de vibration PM6 pour le complexe NTA-métal et les produits amb. Ensuite, entrez la description du TS en orbite. Entrez 1.0 pour la charge de l’ion complexe NTA-métal, et entrez la polarisabilité et le moment dipolaire de l’amb. Sélectionnez 0 Kelvin pour la température de rotation et dipôle verrouillé pour le traitement de l’état de transition orbitale.
Entrez les masses moyennes du complexe métallique NTA et des produits amb. Appuyez sur Entrée pour lire les constantes de rotation 1D et 2D des fichiers de modélisation. Sélectionnez 0 pour les rotors entravés, 1 pour la symétrie moléculaire et 1 pour la dégénérescence réactionnelle.
Ensuite, entrez Aucune modification. Pour gérer les rotations 2D inactives, sélectionnez les options par défaut pour la distribution statistique du moment angulaire et intégrez la distribution P-E, G sur J. Utilisez la valeur par défaut de 32 dans le nombre de points de l’intégration.
Pour le menu Modèle, sélectionnez Optimiser les paramètres pour ajuster les données, puis entrez respectivement l’énergie minimale et l’énergie maximale pour commencer et terminer l’ajustement des données. Sélectionnez 1 pour les écarts-types expérimentaux des modèles de pondération. Sur la base des données, sélectionnez un écart-type minimum acceptable de 0,01 à 0,001.
Utilisez la valeur par défaut de la limite de convergence E0 et sélectionnez Non pour conserver un paramètre à la valeur actuelle, 0,5 et 2,0 électronvolt pour les limites inférieure et supérieure et 2 pour la méthode d’évaluation de la dérivée. Dans le menu Optimisation, sélectionnez Commencer l’optimisation. Le programme CRUNCH optimisera le modèle TCID sélectionné en fonction des données expérimentales.
Enfin, dans le menu Modèle, sélectionnez delta-H et S à T pour l’évaluation thermochimique des deux canaux de dissociation. L’image représentative montre les structures primaires des peptides alternatifs A et H liant les métaux. La couleur met en évidence les sites de liaison métallique potentiels.
La dépendance énergétique pour la formation des ions amb-métal et NTA-produit métallique est illustrée ici. L’énergie de collision du centre de masse, où il y a 50% de dissociation du complexe ternaire amb-métal-NTA, est incluse dans les graphiques. Les images représentatives montrent le modèle dynamique pour la méthode TCID résolue en énergie.
Les collisions entre le complexe ambH-zinc-NTA et l’argon entraînent la dissociation en complexe ambH-zinc et NTA libre, ou complexe NTA-zinc et produits ambH libres. Les énergies seuils E1 et E2 correspondent aux enthalpies 0 Kelvin de dissociation pour les réactions ambH-zinc-NTA complexe ambH-zinc au complexe ambH-zinc et NTA libre, ou complexe ambH-zinc-NTA au complexe NTA-zinc et ambH libre, respectivement. Les complexes ternaires amb-métal-NTA PM6 optimisés pour la géométrie de A et H sont présentés ici.
Ces conformistes ont été utilisés dans la modélisation TCID des données expérimentales et ont été sélectionnés parmi d’autres structures candidates en comparant leurs énergies électroniques PM6 et la façon dont leurs sections efficaces de collision calculées par rapport aux sections transversales de collision mesurées par IM-MS. Le TCID à résolution énergétique des quatre complexes amb-métal-NTA est représenté dans ces images. Pour les espèces A et H, les ions produits amb-métal et NTA-métal avec les ajustements de seuil CRUNCH alambiqués sont présentés ici.
Les valeurs d’énergie sont les enthalpies de dissociation à 0 Kelvin pour les réactions amb-metal-NTA à amb-métal et NTA libre, ou amb-métaL-NTA à NTA-métal et amb libre. Une comparaison des énergies libres d’association de Gibbs en kilojoules par mole et des constantes de formation dérivées des enthalpies de dissociation, net zéro Kelvin, avec des calculs de mécanique statique utilisant les paramètres PM6 est présentée ici. La réaction du NTA-nickel et de l’ambA libre pour former le complexe ambA-nickel-NTA présente la constante de formation la plus élevée et représente la réaction où la protéine marquée par l’ambA est immobilisée par le NTA-nickel à l’intérieur de la colonne d’affinité.
Le montage CRUNCH nécessite un criblage minutieux des réactifs et des produits pour obtenir des énergies seuils précises. Une expertise en modélisation moléculaire pour obtenir les structures et les paramètres moléculaires fiables est requise. Les méthodes globales décrites ici pourraient être développées pour cribler l’efficacité des molécules conçues pour lier les cofacteurs métalliques et les sites actifs des protéines pour bloquer les fonctions enzymatiques.
