Notre protocole porte sur les effets des protéines de liaison à l’ARN régulateur sur la biogenèse et la maturation des microARN, directement à partir de cultures cellulaires. La méthode que nous décrivons peut être réalisée avec des réactifs de culture cellulaire courants et est relativement rapide. Cette méthode peut être importante pour étudier les effets phénotypiques des microARN et de leurs cibles dans différents types de cellules eucaryotes.
Des cellules normales ou semblables à des maladies peuvent être utilisées. Il est important de choisir des lignées cellulaires susceptibles de transfection, d’effectuer des contrôles adéquats de transfection et d’induction afin d’observer les changements d’affinité de la cible par l’activité de la luciférase. Pour commencer, maintenez les cellules dans DMEM, supplément de glucose élevé dans des boîtes de Petri de 100 millimètres et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à atmosphère contrôlée humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.
Pour détacher les cellules adhérentes, incuber avec une solution de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Pour effectuer des transfections, mélangez 200 nanogrammes d’ADN et 1,25 microlitre de réactif de transfection dans 100 microlitres du milieu de culture et ajoutez le mélange de transfection aux cellules. Ensuite, incuber les cellules avec les mélanges de transfection pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, remplacez le milieu par un milieu contenant 10% de FBS et incuber pendant 24 heures supplémentaires avant d’ajouter les antibiotiques pour la sélection. Pour transfecter pFLAG-HuR et MT-pFLAG en HeLa, sélectionner des cellules en augmentant la concentration de Geneticin de 100 microgrammes par millilitre à 1000 microgrammes par millilitre, générant des lignées cellulaires stables. Ensuite, confirmez la surexpression par PCR quantitative en utilisant des amorces spécifiques pour l’ARNm HuR.
Transfecter les plasmides dans les cellules HeLa-Cre avec 40 nanogrammes pTK-Renilla, puis pRD miR 17-92, générant HeLa-Cre miR 17-92, et sélectionnant avec un microgramme par millilitre de puromycine. Ensuite, transfectez HeLa-Cre miR 17-92 avec pTK-Renilla et pmirGLO RAB1B 3'UTR ou pmirGLO brouillé 1B 3'UTR séparément. Ensuite, sélectionnez en utilisant la pénicilline et la streptomycine, ce qui entraîne la génération de luc RAB1B et luc brouillé.
Ensuite, transfectez les cellules avec pFLAG-HuR ou MT-PFLAG comme ils l’ont démontré précédemment. Procéder à la culture cellulaire avec HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 brouillé, HeLa-Cre miR 17-92 HuR et HeLa-Cre miR 1792 HuR jusqu’à ce qu’environ 80% de confluence soit atteinte. Ensuite, induisez avec un microlitre de doxycycline pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et gardez également toutes les cellules sans doxycycline comme témoins pendant la même période.
Pour quantifier et comparer différentes intensités de luminescence, utilisez le kit de test double rapporteur de luciférase. Avant de commencer le dosage, décongelez les solutions de dosage de la luciférase et laissez-les à température ambiante. Ensuite, préparez le mélange Stop et Glo en mélangeant 200 microlitres du substrat dans 10 millilitres de tampon de dosage de luciférase deux.
Ensuite, mélanger 10 millilitres de tampon de dosage de luciférase deux dans le vil ambré du substrat de dosage de luciférase deux pour préparer le mélange, LAR II, et bien agiter. Ensuite, transférer les solutions dans des tubes centrifugés de 15 millilitres préalablement identifiés et protégés de la lumière. Ensuite, effectuez les lectures de luminescence à l’aide d’équipements tels que Synergy et mesurez la luciférase exprimée en unités de lumière relative, puis exportez les résultats vers une feuille de calcul pour une analyse statistique plus approfondie.
Effectuer la normalisation de l’activité de la luciférase des lucioles par le contrôle Renilla et tracer cela comme unités de lumière relative dans un graphique tout en répétant pour les groupes avec et sans induction de doxycycline. La surexpression de HuR lors de la transfection de pFLAG-HuR a été confirmée dans la lignée cellulaire HeLa, BCPAP et HEK293T, et il a été observé que la surexpression de HuR dans ces cellules stimule l’expression de miR19A. Une forte réduction de l’activité de la luciférase a été observée avec RAB1B 3'UTR lors de l’augmentation de l’expression de miR19A et miR19B de pRD miR 17-92, par rapport aux cellules HeLa-Cre.
La transfection de pFLAG-HuR dans les cellules HeLa n’a pas modifié l’activité de la luciférase. Cependant, la surexpression de HuR, associée à une supplémentation en doxycycline stimulant l’expression du groupe miR 17-92, a encore réduit l’activité de la luciférase. Après avoir confirmé le rôle de la protéine de liaison à l’ARN dans la maturation des microARN, la cinétique cellulaire et l’analyse du cycle cellulaire seront importantes pour comprendre les changements majeurs promus par la protéine dans les microARN.
