Ce protocole décrit séquentiellement les étapes impliquées dans l’induction de l’inflammation de la surface oculaire et la collection d’organes affectés associés impliqués dans le dysfonctionnement de la glande de Meibomius. Ce nouveau modèle de MGD permet d’étudier l’aspect immunitaire inné de la maladie, en particulier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles obstruant la glande de Meibomius. La technique exposée dans le protocole peut être étendue pour introduire des interventions thérapeutiques topiques au stade préclinique.
De plus, la collecte d’exsudats oculaires et d’organes reflète l’efficacité du traitement. Pour effectuer une injection intrapéritonéale de la solution d’immunogène, tenez doucement la souris femelle noire C57 six non anesthésiée âgée de sept à neuf semaines par la queue tout en saisissant la grille de la cage. Ensuite, tenez fermement la peau du dos et de la région du cou entre le pouce et l’index et fixez la queue et les membres inférieurs entre l’anneau et le petit doigt contre la paume.
En gardant la souris fixe avec la tête vers le bas, injectez 100 microlitres de la solution d’immunogène préparée dans le quadrant droit ou gauche de la cavité abdominale inférieure. Pour effectuer une provocation de la surface oculaire après l’immunisation, appliquez cinq microlitres d’ovalbumine ou d’ovules ou de solution saline par œil d’une souris anesthésiée et attendez cinq minutes pour que la goutte soit absorbée par l’œil. Ensuite, prélevez les exsudats oculaires en appliquant 50 microlitres de solution saline stérile sur l’œil immédiatement après la provocation.
Pour l’excision des tissus de surface oculaire, placez la souris sur une surface plane et désinfectez la zone orbitale autour de l’œil avec un écouvillon à 70% d’éthanol. Pour former une incision autour de l’œil, faites une incision entre l’oreille et le sinus rétroorbitaire et le long de la surface au-dessus de l’os pavimenteux verticalement, en étendant l’incision horizontalement sous la paupière inférieure le long de l’os maxillaire et au-dessus de la paupière supérieure le long de l’os frontal. Tenez soigneusement le tissu disséqué autour de l’œil à l’aide d’une pince incurvée et retirez le tissu et le globe oculaire.
Placer les organes excisés dans du PBS stérile. Ensuite, à l’aide d’un scalpel au stéréomicroscope, coupez l’excès de tissu musculaire facial autour des paupières supérieures excisées. Pour recueillir la conjonctive, placez la paupière supérieure sur une boîte de Petri sèche.
Ensuite, à l’aide d’une fine pince à épiler et d’un scalpel, décollez doucement la couche de mucus blanchâtre de la surface interne de la paupière. Après disséquer la cornée, placez le globe oculaire sur une nouvelle boîte de Petri sèche sur de la glace sèche. Après trois minutes, placez le plat sur la surface du banc dans une position stable.
Utilisez des ciseaux fins et tranchants pour faire une petite incision au bord de la cornée à côté du limbe. Continuez l’incision avec le scalpel autour du globe oculaire, en séparant la sclérotique de la cornée. Ensuite, retirez les restes d’iris et de lentilles de l’arrière de la cornée en rinçant généreusement avec une solution saline.
Pour évaluer la glande de Meibomius et ses orifices, placez les paupières excisées en position verticale sous le stéréomicroscope. Ensuite, en fonction du temps d’exposition de l’appareil photo et des paramètres ISO, capturez des images sous épi-éclairage à lumière blanche. Pour évaluer la zone de la glande de Meibomius, placez les paupières excisées en position horizontale et allumez le rétroéclairage du stéréomicroscope équipé d’une caméra infrarouge.
Capturez des images en ajustant le temps d’exposition en fonction de l’ISO de l’appareil photo. Les souris administrées par la solution saline ont montré des surfaces oculaires saines avec les yeux grands ouverts. En comparaison, l’application d’ovules induit une inflammation sévère de la surface oculaire, l’ouverture étroite des yeux et des signes de chimiose.
Les paupières excisées présentaient de grandes occlusions obstruant les orifices de la glande de Meibomius et un œdème, contrairement aux paupières saines montrant de petits bouchons de la glande tapissant la paupière. Un examen plus approfondi de la transillumination infrarouge de la glande révèle l’aspect racémique des acini de la glande de Meibomius. Les paupières des souris défiées par une solution saline montraient les acini ronds.
En comparaison, les applications d’ovules ont induit la destruction et la perte de certaines glandes avec la maladie oculaire allergique ou DEA. L’analyse histologique des paupières a montré des glandes dilatées de Meibomius par rapport aux souris administrées avec seulement une solution saline. L’incubation du globe oculaire sur de la glace sèche a permis une incision à la cornée à côté du limbe et la séparation de la cornée de la sclérotique.
Cette étude a facilité la collecte de la cornée. De plus, l’administration d’ovules a infligé une inflammation sévère à la conjonctive avec un aspect hyperémique. Des niveaux élevés de chimiokine CXCL-1 facilitent l’extravasation des neutrophiles, la phagocytose et la dégranulation, et l’interleukine-6 médiant la réponse de phase aiguë et l’infiltration des neutrophiles ont été observés chez les surnageants de souris DEA.
D’autre part, la concentration d’interleukine-10 n’a montré aucun changement significatif chez les souris naïves et les souris DEA. Ce nouveau modèle permet le développement et l’évaluation de l’efficacité de médicaments qui ciblent les voies immunitaires innées, et est d’une grande aide dans l’exploration de données sur le mode d’administration des agents anti-inflammatoires. Après une collecte appropriée des organes, des méthodes hautement multiplex telles que le séquençage de cellules uniques et la cytométrie de masse par imagerie sont compatibles avec ce protocole.
