Ce protocole offre une voie d’accès facile dans le monde de plus en plus populaire mais complexe de la cryotomographie électronique. Six spécimens cellulaires peuvent être imagés. Institut dans un état proche de l’état d’origine.
Les micromolécules peuvent ensuite être résolues à haute résolution dans leur environnement cellulaire natif en utilisant la moyenne CROW, ET et sous-atome. Commencez par démarrer le logiciel Tomo five à partir du PC serveur TEM. Démarrez la session configurée en ajustant les paramètres d’acquisition d’image dans l’onglet de préparation, sous préréglages.
Copiez les paramètres d’acquisition d’image dans tous les autres préréglages à fort grossissement. Appuyez sur Régler"pour régler l’exposition au microscope et Get"pour obtenir les paramètres d’exposition sur tous les autres grossissements élevés après les avoir sélectionnés individuellement. Pour collecter un atlas, cliquez sur l’onglet Nouvelle session dans l’Atlas.
Définissez les préférences de session. Entrez le chemin de stockage et le format de sortie et appuyez sur Appliquer. Sélectionnez Screening » et cochez tous les atlas à acquérir.
Sélectionnez Close Call Valves"Si le microscope n’est pas supervisé, cela fermera les vannes de colonne. Ensuite, pour démarrer la projection, appuyez sur le bouton de démarrage. Inspectez les atlas à la recherche de cibles simples ou multiples en cliquant sur la grille dans le panneau de gauche sous Configuration de la session"Cliquez avec le bouton gauche de la souris et faites glisser la souris pour vous déplacer et faites défiler du milieu pour effectuer un zoom avant et arrière.
Choisissez la grille pour la configuration cible. Sélectionnez-le et cliquez sur Charger l’échantillon « à l’intérieur du logiciel. Pour effectuer l’étalonnage du décalage de l’image, dans l’onglet Fonctions automatiques, réglez le préréglage sur Hauteur eucentrique"Naviguer vers l’eucentrisme automatique"par inclinaison de la scène, puis appuyez sur Démarrer.
Si la fonction est restée centrée pendant le ciblage, ignorez les étalonnages de décalage de l’image. Sinon, allez dans l’onglet Préparation « pour calibrer le décalage de l’image, sélectionnez Calibrer le décalage de l’image"et appuyez sur Démarrer. Cela alignera les grossissements inférieurs sur la caractéristique centrée sur le grossissement de l’exposition.
Pour la configuration de la tomographie, démarrez une nouvelle session dans Configuration de la session"pour les échantillons biologiques. Choisissez Slab comme"comme type d’échantillon et sélectionnez Batch"et Low Dose"Sélectionnez ensuite le dossier Format de sortie et stockage ». Si vous le souhaitez, ajoutez un destinataire d’e-mail et appuyez sur Appliquer"Pour configurer les cibles, accédez à la flèche de l’atlas, recherchez une région d’intérêt et déplacez-vous en sélectionnant les options qui apparaissent avec un clic droit.
Prenez une image de vue d’ensemble pour confirmer une bonne position pour le réglage de la hauteur eucentrique. Appuyez ensuite sur autoeucentric"pour exécuter la routine d’inclinaison eucentrique par étage, réacquérir une nouvelle image de vue d’ensemble pour mettre à jour la hauteur eucentrique. Inspectez la vue d’ensemble du carré ou la carte de recherche acquise.
Déplacez-vous vers une région d’intérêt et appuyez sur acquérir la recherche. Ensuite, inspectez l’image de recherche si la région d’intérêt n’est pas centrée, faites un clic droit à la position souhaitée et répétez l’étape Déplacer ici « et acquérir l’image. Ajustez les zones de mise au point et de suivi.
Cliquez avec le bouton gauche de la souris pour faire glisser les zones de suivi et de mise au point. Une fois tous les paramètres définis, appuyez sur Ajouter une position"Pour effectuer des fonctions automatiques, vérifiez les paramètres pour effectuer les alignements via l’onglet Fonctions automatiques » en naviguant dans l’atlas vers une zone de carbone. Amenez cette zone à la hauteur eucentrique et suivez l’ordre des alignements décrit dans le manuscrit du texte.
Ensuite, lancez l’acquisition automatisée de l’onglet tomographie. Sélectionnez la dalle d’acquisition de données et définissez les paramètres souhaités. Configurez les paramètres d’acquisition de données: pas d’inclinaison, angle positif maximal, angle négatif maximal, schéma de suivi.
Sélectionnez ensuite Fermer les vannes à colonne » pour le schéma de hauteur eucentrique. Commencez par préparer les fichiers d’entrée et les répertoires. Créez un dossier de projet sous le dossier Projet ».
Créez un autre nouveau dossier piles fixes et préparez les fichiers d’entrée. Série d’inclinaison une série d’inclinaison fixe 1. XF et tilt series 1.tlt.
Pour calculer la défocalisation, mettez à jour le fichier de paramètres avec les paramètres du microscope et de l’imagerie. Copiez un fichier de paramètres dans le dossier du projet. Changez son nom en param_CTF.
M et exécutez la commande indiquée. Ensuite, vérifiez les résultats de l’estimation CTF. Pour chaque pile, vérifiez les piles alignées à l’aide de 3D mod et assurez-vous que les perles fiduciaires sont effacées correctement.
Assurez-vous que la manipulation est correcte en exécutant la commande indiquée. Vérifiez ensuite la valeur de défocalisation et assurez-vous qu’elle correspond à l’estimation théorique du CTF. Pour définir les sous-régions, générez un tomogramme courbé.
Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Déterminez les limites en choisissant six points Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin et Zmax, pour créer une sous-région sous le dossier bin10, exécutez la commande indiquée. Ensuite, exécutez la sélection des particules pour chaque sous-région.
Pour l’ensemble de données sur l’apoferritine, effectuez une recherche de modèle à bin six. Modifiez l’angle de soulignement du modèle. Paramètres de recherche pour déterminer l’angle, la plage et les intervalles pour la recherche dans le plan ou hors plan en degrés.
Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Supprimez les particules incorrectes à l’aide de 3D mod sous le dossier. Convmap_wedge_Type2_bin6. Exécutez la commande indiquée.
Ensuite, initialisez le projet. Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée pour créer une base de données pour la clarté EM, AppoF.mat. Effectuez la reconstruction du tomogramme avant la moyenne et l’alignement du sous-tomo pour générer des tomogrammes de sous-région corrigés CTF à bin4, exécutez la commande indiquée.
Ensuite, pour effectuer la moyenne et l’alignement subtom, effectuez la moyenne à l’aide des sous-télégrammes corrigés CTF à partir de bin4. Dans le dossier du projet, exécutez la commande indiquée. Continuez à effectuer des alignements et exécutez la commande.
Nettoyez les particules superposées en exécutant la commande indiquée. Effectuez la reconstruction finale en combinant les deux demi-ensembles de données. Dans le dossier du projet, exécutez les commandes indiquées.
Un aperçu du flux de travail tomographie pour la tomographie cellulaire et moléculaire est présenté ici pour les échantillons cellulaires et lamelles, la stratégie de collecte de données dépend en grande partie de l’échantillon et de l’objectif de l’étude d’imagerie. Les paramètres de collecte pour plusieurs études cryo ET sont présentés ici. Des tomogrammes représentatifs d’échantillons moléculaires tels que l’apoferritine, les processus cellulaires minces et les lamelles broyées par faisceau d’ions focalisés du spécimen cellulaire épais sont présentés ici.
L’analyse structurelle à haute résolution peut aider à révéler les sites de liaison pour les cibles médicamenteuses et la tomographie et la moyenne sous-tomograle ont également contribué au développement de vaccins contre le SRAS-CoV-2.
