Le fraisage FIB corrélatif 3D rend les événements cellulaires spécifiques et même rares accessibles à Cryo-TEM. Permettre la révélation de l’ultra structure de cet événement directement au sein de l’environnement natif. Le flux de travail corrélatif améliore le taux de réussite du ciblage des structures cellulaires rares et permet de les identifier sans ambiguïté dans l’environnement cellulaire encombré.
Anna Bieber et Christina Capitanio, expertes en cryotomographie électronique corrélative, feront la démonstration de la procédure. Commencer la cryo-microscopie de fluorescence des grilles ensemencées de cellules en acquérant une vue d’ensemble à large champ en mode fluorescence et réfléchi. Ensuite, sélectionnez des carrés de grille appropriés avec un signal de fluorescence.
Après vous être assuré que les cellules et les billes sont uniformément réparties vers le centre de chaque carré, choisissez les carrés sur des grilles de 200 mailles qui sont accessibles à la fois à l’instrument FIB-SEM et TEM, et qui sont à au moins trois carrés du bord de la grille. Sur chacun des carrés de la grille sélectionnés, procurez-vous une pile fluorescente avec une étape de mise au point appropriée. Des objectifs à ouverture numérique élevée doivent être utilisés pour augmenter le nombre de photons et la précision de la localisation.
Sur un microscope confocal avec un objectif à ouverture numérique de 0,9, acquérir des empilements avec une taille de pas de 300 nanomètres et suréchantillonner la valeur de Nyquist. Enregistrez plusieurs piles de couleurs et stockez les grilles sous azote liquide jusqu’à leur utilisation. Utilisez les marques de découpe ou d’orientation pour assurer une orientation correcte de la grille en vue d’un placement ultérieur dans le MET.
Chargez les grilles dans l’instrument cryo FIB-SEM. Assurez-vous que la direction de fraisage est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du MET. Pour recouvrir les grilles d’une couche organométallique protectrice, utilisez un codeur plasma et un système d’injection de gaz aux positions de platine prédéfinies par la configuration FIB-SEM.
Ensuite, enregistrez la vue d’ensemble de la grille MEB et effectuez une corrélation 2D avec les vues d’ensemble FLM. Trouvez les carrés de la grille en inspectant manuellement les aperçus de la grille enregistrés ou à l’aide d’un logiciel. Sélectionnez et marquez quatre positions correspondantes pour les carrés dans l’aperçu de la grille FLM et MEB et calculez la transformation entre les points marqués pour la corrélation FLM-SEM.
Ensuite, placez les marqueurs au centre des carrés de grille correspondants pour lesquels les piles FLM ont été acquises avant de prédire leur position dans la vue SEM. Pour chaque carré de grille corrélé, prenez une image de faisceau d’ions à faible courant à l’angle de fraisage FIB de votre choix et sélectionnez un champ de vision avec la position et le grossissement souhaités qui correspondent aux données de fluorescence. Pour les grilles à 200 maillages, acquérez des données FIB-SEM pour contenir des carrés de grille uniques, y compris les barres de grille.
Ensuite, prenez une image MEB du même carré pour faciliter l’identification des billes correspondantes dans la vue de fluorescence et de faisceau d’ions. Effectuez l’enregistrement de la pile FLM 3D brute ou déconvoquée et de la vue du faisceau d’ions 2D pour chaque position avec la boîte à outils de corrélation 3D, 3D CT, en chargeant la vue correspondante de la pile FLM 3D et du faisceau d’ions en 3D CT.In les données de fluorescence, sélectionnez quatre perles de repère et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la liste des positions pour déterminer la position 3D des billes via un ajustement gaussien du signal en X, Y et Z.Ensuite, sélectionnez les billes correspondantes dans l’image du faisceau d’ions pour effectuer une corrélation 3D initiale. De même, ajoutez d’autres billes à l’enregistrement pour vérifier l’exactitude de la corrélation.
Laissez de côté certaines billes de repère clairement identifiables à la fois dans la fluorescence et dans le faisceau d’ions en vérifiant leur emplacement prédit par rapport à leur emplacement réel dans l’image du faisceau d’ions. En TDM 3D, l’erreur quadratique moyenne (erreur quadratique moyenne) peut être visualisée pour évaluer la cohérence de la corrélation. Assurez-vous que les valeurs RMSE sont petites et de l’ordre de la précision de la localisation.
Ensuite, sélectionnez les signaux cellulaires ciblés et ajustez la position 3D dans la pile FLM avant d’appliquer la transformation pour prédire les positions cibles dans la vue du faisceau d’ions. Pour chaque carré corrélé, transférez les positions prédites des caractéristiques d’intérêt à l’instrument FIB-SEM pour placer les motifs de fraisage des lamelles. S’il y a plusieurs signaux par cellule, placez les motifs de manière à inclure le maximum de points d’intérêt possibles dans la même lamelle.
Fraisage grossier des lamelles suivi d’un broyage fin pour obtenir une épaisseur finale de 150 à 250 nanomètres. Assurez-vous que l’orientation des lamelles est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison lors du chargement des grilles dans le microscope électronique à transmission. Acquérez un montage de grille et des vues d’ensemble pour chaque carré de grille contenant des lamelles avec un grossissement et un temps d’exposition appropriés pour visualiser les perles de repère dans les images TEM sans ajouter de manière significative à la dose totale d’électrons.
Acquérir des cartes MET à haute résolution de chaque lamelle. Le registre et la 3D-2D corrèlent la pile FLM avec le carré de la grille TEM et les vues d’ensemble des lamelles en TDM 3D. Effectuer une corrélation entre FLM et TEM d’un grossissement faible à élevé dans TEM. Après avoir transféré les positions, configurez et exécutez des séries d’inclinaison à des positions corrélées, puis utilisez un grossissement, un défocalisme et une dose totale appropriés pour commencer l’acquisition de l’image au pré-inclinaison déterminé par la lamelle à l’aide d’un schéma d’inclinaison symétrique de dose.
Suivre l’acquisition manuelle ou par lots d’images. Dans l’analyse représentative, la vue d’ensemble MET à faible grossissement du site de broyage permet de localiser les caractéristiques biologiques d’intérêt. Plus tard, une vue à fort grossissement a été corrélée avec la projection de l’intensité maximale du FLM et des positions pour l’acquisition du tomogramme ont été définies.
Dans les images acquises, le dépôt de protéines endocytaires a pu être visualisé dans son environnement d’origine. L’optimisation de l’échantillon est très importante. La préparation de la grille doit être optimisée pour avoir une bonne répartition des cellules à fraiser et un bon nombre de perles de repère visibles dans la plupart des carrés de la grille.
Le fraisage corrélatif 3D a permis de révéler l’ultrastructure de différents processus cellulaires, tels que la progression étape par étape de l’autophagie dans chaque cellule, et il est utilisé pour capturer un nouveau compartiment séparé par phase.
