Cette méthode répond aux défis de l’observation par fluorescence profonde dans les pousses de riz, tels qu’une pénétration tissulaire limitée de la solution de nettoyage et la résolution réelle au microscope confocal. Le principal avantage de cette technique est l’observation de la structure de tissus beaucoup plus volumineux d’un point de vue macro, même avec des tissus durs et épais, tels que des pousses adultes. Cette méthode s’applique à l’imagerie profonde des tissus durs et épais chez les espèces végétales larges.
Elle peut contribuer à accélérer la découverte de nouveaux phénomènes dans la recherche en biologie végétale. Pour commencer, coupez soigneusement les racines sans endommager les plantes et lavez-les à l’eau pour enlever la saleté. Maintenant, utilisez une pince à épiler pour décoller les vieilles feuilles extérieures.
Pour éviter d’écraser les cellules, utilisez un rasoir à simple tranchant avec un mouvement de glissement pour couper le tissu de la pousse, du méristème apical ou de la jeune panicule à la base. Si la position du méristème apical de la pousse ou de la jeune panicule n’est pas visible, coupez-la plus longtemps. La pousse de riz a une section transversale ovale.
Utilisez un rasoir à double tranchant pour raser finement un côté de l’ovale, dans le sens de son axe long. Confirmez la position du méristème apical de la pousse ou de la jeune panicule par l’apparition d’une couleur blancheâtre dans l’échantillon et coupez l’excès de tissu. Placez l’échantillon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant un millilitre de solution fixatrice.
Coupez un morceau de film de paraffine de 2,5 centimètres carrés et façonnez-le en boule. Maintenant, placez ces boules sur les échantillons pour les empêcher de flotter hors de la solution fixatrice. Placer le tube contenant l’échantillon dans un dessiccateur.
Fermez le couvercle du dessiccateur et démarrez la pompe à vide pour dépressuriser lentement l’intérieur du dessiccateur jusqu’à ce que la pression de moins 0,095 mégapascals soit atteinte. Après avoir fermé le dessiccateur à moins 0,095 mégapascal, éteignez la pompe à vide et laissez-la reposer pendant 30 minutes à température ambiante. Ouvrez légèrement le dessiccateur et ramenez-le lentement à la pression atmosphérique.
Si l’échantillon est correctement fixé, il s’enfonce dans la solution fixatrice. Et s’il ne coule pas, réduisez à nouveau la pression. Retirez le film de paraffine.
Fermez le couvercle et conservez les tubes toute la nuit à quatre degrés Celsius. À l’aide de lingettes non pelucheuses, retirez l’excès de solution fixatrice de l’échantillon et fixez l’échantillon sur un plateau micro-trancheur vibrant avec de la colle instantanée. Placer l’échantillon sur un plateau avec le côté plat vers le bas qui a été rasé pendant l’échantillonnage et régler les conditions de parage en fonction de l’échantillon fixé.
Ajustez la position de l’échantillon à l’aide du bouton d’inversion ou d’avance et du bouton haut ou bas et remplissez le plateau d’eau désionisée jusqu’à ce que tous les échantillons soient immergés. Après avoir rempli le plateau, appuyez sur le bouton de démarrage et placez les échantillons coupés sur une lame de verre avec une goutte de PBS. Vérifiez l’échantillon contenant le site cible au microscope stéréoscopique et transférez l’échantillon taillé dans une plaque multipuits avec un millilitre de PBS.
Retirez le PBS de la plaque multipuits. Ajoutez du PBS frais et laissez-le reposer pendant une minute. Supprimez PBS et ajoutez le CS. Placer la plaque multipuits contenant l’échantillon dans un dessiccateur et fermer le couvercle.
Ensuite, démarrez la pompe à vide pour dépressuriser l’intérieur du dessiccateur jusqu’à moins 0,09 mégapascal, lentement. Après avoir fermé le dessiccateur à moins 0,09 mégapascal, éteignez la pompe à vide et laissez-la reposer pendant une heure à température ambiante. Ouvrez légèrement le dessiccateur et ramenez-le lentement à la pression atmosphérique.
Versez de l’eau désionisée dans l’espace entre les puits pour empêcher l’évaporation du CS et stockez les plaques multipuits à température ambiante dans l’obscurité pour le nettoyage. Lorsque le CS passe au vert, remplacez-le par une solution fraîche. Les échantillons non taillés sont restés verts et ne sont pas devenus transparents après trois mois de traitement avec les échantillons CS.In qui ont été décollés de toutes les feuilles les entre-nœuds sont devenus blancs après une semaine, bien que les nœuds soient restés verts.
L’échantillon n’est pas devenu transparent après quatre semaines. Les échantillons parés à la main sont devenus blancs après une semaine de traitement CS, mais ne sont pas devenus transparents après quatre semaines. Les échantillons taillés à 130 micromètres d’épaisseur sont devenus translucides après une semaine de traitement CS.
L’échantillon était presque transparent après deux semaines. Dans le nœud, la profondeur observable après une semaine de traitement CS était de moins 60 micromètres et de moins 90 micromètres après deux semaines. Des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de moins 80 micromètres à trois semaines et à une profondeur de moins 100 micromètres à quatre semaines.
Dans l’entre-nœud, des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de moins 60 micromètres sans le traitement CS. La profondeur observable était de moins 90 micromètres après une semaine à trois semaines de traitement CS et de moins 100 micromètres après quatre semaines. Dans les feuilles, des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de moins 90 micromètres sans traitement CS, mais la luminosité était plus faible que celle des autres tissus.
Après une semaine, les signaux étaient plus brillants et observés à une profondeur de moins 120 micromètres. L’expression du facteur de transcription OS MASU 15 mOrange a été observée chez les jeunes panicules, feuilles, nœuds, entre-nœuds et fleurettes. La clé est de trouver les meilleures conditions pour les plantes ou les tissus, par exemple, la pression de période et de vide, ou la position, et le traitement CS, le timing, l’épaisseur, la vitesse et la solution de coloration appropriée.
La combinaison de la technologie de synchronisation et de durcissement permet l’observation temporelle spatiale du modèle d’expression génique et de la communication intercellulaire dans plusieurs tissus d’une seule section.
