La technique Flow-Enhanced Ultrasound nous permet d’imager la vascularisation de l’œil en trois dimensions, sans utiliser d’agents de contraste. Le principal avantage de cette technique est sa stabilité pour imager le vesture, derrière la rétine pigmentée, ce qui est difficile avec plusieurs techniques d’imagerie optique. Nous démontrons cette technique chez les poissons rouges, mais elle peut être appliquée à toutes les espèces avec des globules rouges nucléés, ce qui permet aux chercheurs de mieux comprendre l’évolution fonctionnelle des yeux.

Cette technique peut être appliquée par des chercheurs ayant une formation de base en imagerie échographique et en manipulation d’animaux. Après avoir confirmé un niveau optimal d’anesthésie, positionnez l’animal dans une posture qui permet un accès direct d’en haut, à l’œil. Placez un milieu échographique approprié sur l’œil de l’animal.

Si des paupières écailleuses couvrent l’œil, déplacez-les doucement avec un coton-tige. Pour les animaux aquatiques, l’eau fonctionne bien comme milieu ultrasonore, Ensuite, positionnez le transducteur à ultrasons, médial à l’œil, dans une orientation caudale dorsale ventrale ou rostrale, en fonction de l’orientation souhaitée de l’image. En mode B, avec une profondeur de champ maximale, imagez la partie médiale et la plus profonde de l’œil, pour vous assurer que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image.

Traduisez lentement le transducteur de chaque côté, tout en inspectant les images en temps réel. Assurez-vous que toutes les structures d’intérêt sont visibles dans le champ d’image. Si ce n’est pas le cas, passez à un transducteur avec une fréquence plus basse et une plus grande profondeur de champ.

Ajustez la profondeur de l’image, le décalage de profondeur, la largeur de l’image et le nombre de zones focales pour couvrir la région d’intérêt souhaitée dans les trois dimensions spatiales. Ensuite, définissez la fréquence d’images dans la plage de 50 à 120 images par seconde. Ensuite, ajustez le gain 2D à un niveau, de sorte que les structures anatomiques ne soient que juste visibles dans l’acquisition du mode B pour augmenter le rapport signal / bruit dans la reconstruction ultérieure améliorée par le flux.

Pour acquérir une image 2D à flux amélioré à une position de tranche unique, traduisez le transducteur à cette position et procédez à la reconstruction d’image améliorée par flux. Pour acquérir un enregistrement 3D d’une région entière d’intérêt, traduisez le transducteur à un extrême de la région d’intérêt. Pour déterminer la position exacte de l’extrémité extrême, augmentez brièvement le gain 2D.

Une fois le transducteur placé correctement, abaissez le gain 2D avant l’enregistrement, afin d’assurer un rapport signal/bruit maximal lors de la reconstruction ultérieure améliorée du débit. Pour chaque étape ou tranche de l’enregistrement 3D, acquérez plus de 100 images. Ensuite, à l’aide d’un micro-manipulateur ou d’un moteur de transducteur intégré, traduisez le transducteur dans toute la région d’intérêt, par pas de 25 ou 50 micromètres, et répétez l’acquisition de plus de 100 images pour chaque étape.

Pour une construction d’imagerie améliorée par flux, exportez les enregistrements au format de fichier DICOM. Pour produire une image à flux unique améliorée basée sur un enregistrement de scène supérieur à 100 images, calculez l’écart type au niveau d’un pixel à l’aide de cette formule et répétez le calcul pour chaque tranche de l’enregistrement 3D. Pour automatiser le calcul de l’écart type et le processus de reconstruction d’image pour plusieurs tranches dans un enregistrement 3D, effectuez cette opération en mode batch à l’aide d’ImageJ et du script macro fourni dans le manuscrit de texte.

Combinez toutes les images reconstruites en une seule pile d’images à l’aide de la commande Images to Stack dans ImageJ. Ensuite, à l’aide de la commande Propriétés, spécifie l’épaisseur de la tranche à partir de la taille d’étape utilisée lors de l’acquisition et enregistre la pile d’images en tant que fichier TIFF 3D. La présence de globules rouges nucléés chez les vertébrés de mammifères adultes non ad fournit un contraste positif du sang qui coule, par rapport aux tissus statiques dans les enregistrements de scène.

Cependant, lorsqu’on analyse maintenant image par image, la distinction claire entre le sang et les tissus environnants est moins évidente. Cette procédure d’amélioration du flux sanguin, essentiellement, compile un enregistrement ponctuel multi-temps dans l’espace 2D, en une seule image, où dans la valeur inhérente du signal, la fluctuation en pixels, positionnés dans le sang qui coule, marque un écart-type plus élevé que le tissu statique environnant, produisant un contraste positif. Dans les acquisitions 3D, plusieurs tranches parallèles avec un espacement connu peuvent être combinées en données d’image 3D.

Il peut être utilisé pour le rendu de volume tridimensionnel et la modélisation anatomique. L’imagerie échographique basée sur Doppler offre également la possibilité d’imager spécifiquement le flux sanguin, cependant, avec moins de sensibilité que cette méthode. Cette procédure d’échographie améliorée par le flux sanguin permet l’imagerie du flux sanguin dans une gamme d’espèces avec des globules rouges nucléés.

Les lits vasculaires oculaires profonds, tels que la choroïde rete mirabile chez certains poissons, peuvent être imagés s’ils sont présents dans l’espèce. La méthode est limitée par l’absence de globules rouges nucléés chez les mammifères, dans laquelle la procédure d’amélioration du flux produit un certain degré de contraste du flux sanguin, mais pas aussi distinct que chez les espèces avec des globules rouges nucléés. Les ultrasons à flux amélioré sont sensibles au bruit de mouvement.

Les mouvements respiratoires peuvent causer un flou de l’image et des artefacts, tels que l’amélioration de la bordure tissulaire. La grille prospective ou rétrospective peut être utilisée pour ajuster le bruit de mouvement. Pour les acquisitions 2D et 3D, il est crucial de limiter les artefacts de mouvement causés par le déplacement de l’animal, en raison d’une anesthésie inadéquate sur un transducteur instable.

Le développement de cette technique a ouvert la voie à l’examen in vivo non invasif des réseaux vasculaires profonds dans l’œil de la grande majorité des vertébrés, qui possèdent des érythrocytes nucléés.