Les tests de capture et d’extension de la boucle D sont les premiers à permettre une quantification impartiale et directe de la formation et des étapes d’extension de la boucle D au cours de la recombinaison homologue dans les cellules de levure à croissance mitotique. Cette technique indépendante de la viabilité permet d’étudier les protéines du métabolisme de la boucle D qu’il ne serait pas possible de démêler autrement des rôles ultérieurs, simplement en regardant les produits BIR. À l’avenir, nous envisageons de transférer ces tests aux cellules humaines afin de mieux comprendre le rôle des protéines clés, y compris BRCA2 et les cas de bloom et Warner kilo dans la recombinaison homologue.
Commencez par centrifuger les échantillons pendant cinq minutes. Remettez la pastille en suspension dans 2,5 millilitres de 1x solution de psoralène et transférez-la dans une boîte de Petri de 60 x 15 millimètres. Pour aucun contrôle de réticulation, remettre la pastille en suspension dans 2,5 millilitres de solution TE1.
Ensuite, réglez la source de lumière UV sur le dessus dans le shaker orbital, réglé à 50 tr / min. Pour réticuler les échantillons à l’aide d’un agent de réticulation UV avec des ampoules à ondes longues de 365 nanomètres. Placez les boîtes de Petri un à deux centimètres sous la source de lumière UV pendant 10 minutes en agitant doucement sur une plaque en plastique ou en plexiglas prérefroidi.
Transférez ensuite l’échantillon dans un nouveau tube de 15 millilitres. Rincez la boîte de Petri avec 2,5 millilitres de solution TE1 et ajoutez-la au tube. Centrifuger les échantillons pendant cinq minutes.
Jetez le surnageant et conservez la pastille à moins 20 degrés Celsius. Placer les échantillons sur de la glace pour les décongeler. Simultanément, préchauffez un bain sec à 30 degrés Celsius.
Remettez les échantillons en suspension dans un millilitre de tampon de sablage et transférez-les dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 3,5 microlitres de solution de zymolyase et mélangez doucement en tapotant. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Et puis placez les tubes sur de la glace. Centrifuger pendant trois minutes et déposer les échantillons sur de la glace. Lavez les échantillons trois fois dans un tampon de pulvérisation d’un millilitre et centrifugez les échantillons pendant trois minutes.
Remettez les échantillons en suspension dans un millilitre de tampon enzymatique de restriction à froid. Centrifuger pendant trois minutes et déposer les échantillons sur de la glace. Répétez le lavage une fois.
Remettez les échantillons en suspension dans un millilitre de tampon enzymatique de restriction 1x froid. Divisez l’échantillon également en deux. Centrifuger les échantillons pendant trois minutes à 16 000 g à quatre degrés Celsius.
Resuspendre un tube de chaque échantillon dans 180 microlitres de tampon enzymatique de restriction 1,4x avec oligos hybridants et un autre tube dans 180 microlitres de tampon enzymatique de restriction 1,4x sans oligos hybridants. Congeler les échantillons dans de l’azote liquide. Décongeler les échantillons sur la glace.
Préchauffez un bain sec à 65 et un autre à 37 degrés Celsius. Aliquote 36 microlitres de l’échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge et quatre microlitres de 1% SDS et mélangé en tapotant doucement le côté du tube. Incuber à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes en tapotant doucement toutes les cinq minutes.
Placer les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation. Ajouter 4,5 microlitres de 10% Triton X-100 et mélanger par pipetage. Ajouter 20 à 50 unités d’enzyme de restriction haute fidélité EcoR1 ou HindIII à chaque échantillon.
Et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure avec une agitation douce toutes les 20 à 30 minutes. Pendant ce temps, un bain sec préchauffé à 55 degrés Celsius et un bain-marie à 16 degrés Celsius. Ajouter 8,6 microlitres de FDS à 10% à chaque échantillon et mélanger par pipetage et taraudage.
Incuber à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 80 microlitres de 10% Triton X-100 à chaque échantillon et mélanger par pipetage. Ajouter 660 microlitres de tampon de ligature 1x sans ATP, un ATP millimolaire à pH 8,0 et huit unités d’ADN ligase T4 à chaque échantillon, et mélanger doucement par inversion.
Incuber 16 degrés Celsius pendant 1,5 heure avec une inversion toutes les 30 minutes. Placez les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation. Après la purification de l’ADN décrite dans le protocole, utilisez deux microlitres d’ADN purifié pour mettre en place une réaction qPCR de 20 microlitres conformément aux instructions du fabricant.
Pour chaque échantillon, mettre en place cinq réactions de contrôle et une réaction de quantification et les exécuter en double. L’analyse du dosage DLC deux heures après la rupture double brin ou l’induction DSB a montré que la réticulation du psoralène est essentielle et que l’efficacité dépend du temps écoulé entre le prélèvement de l’échantillon et la qPCR. Les valeurs de Cp d’ARG4 étaient similaires entre les échantillons réticulés, mais plus faibles pour l’échantillon sans réticulation, car l’ADN sans réticulation amplifie plus efficacement.
Pour tous les échantillons, le contrôle qPCR par ligature intermoléculaire se situait dans la plage. L’induction robuste de la DSB a été mise en évidence par un faible signal qPCR pour le contrôle qui s’amplifie à travers le site de reconnaissance de l’endonucléase HO. Des résultats similaires ont été observés pour le contrôle de qPCR EcoR1.
Le signal DLC avec oligo hybridant a été calculé en normalisant le contrôle de ligature intermoléculaire. L’analyse du test DLE effectuée six heures après l’induction de la DSB a montré que les valeurs de CP ARG4 étaient similaires entre l’échantillon d’oligos hybridants et sans échantillon. Le contrôle qPCR par ligature intermoléculaire a révélé un signal acceptable pour l’échantillon d’oligos avec et sans hybridation, mais un signal plus faible pour l’échantillon échoué.
Dans les trois échantillons, il y avait une induction DSB robuste. Puisque le clivage HindIII dépend de la restauration du site enzymatique de restriction par l’oligo hybridant. Il y avait une différence significative d’amplification à travers le site de clivage HindIII sur le brin réséqué entre la largeur et sans échantillons oligo.
Une différence d’amplification plus faible à travers le site sur le brin étendu a été observée parce qu’ici le clivage HindIII dépend également de l’extension. Les échantillons et le tampon doivent être conservés au froid en tout temps. Les échantillons doivent être surgelés après remise en suspension dans un tampon enzymatique de restriction à froid 1,4x avec ou sans oligos hybridants.
Les effets en aval de la formation et de l’extension de la boucle D sur la formation du produit peuvent être étudiés à l’aide du transfert de Southern ou des tests génétiques. Les effets sur la recherche d’homologie peuvent être étudiés en utilisant une PC élevée. L’immunoprécipitation de la chromatine peut fournir des informations sur le recrutement d’une protéine d’intérêt.
