La production de souris génétiquement modifiées et l’analyse de leur phénotype nous permettent de comprendre en détail des fonctions génétiques spécifiques, in vivo. De nombreuses découvertes importantes ont été découvertes à l’aide de modèles animaux génétiquement modifiés. La méthode que nous décrivons ici permet à un ADN long d’implanter des cellules souches avec une efficacité acceptable sans sélection de médicament.
La technique est bénéfique non seulement pour les sciences fondamentales de la vie, mais les résultats seront également mis en œuvre dans les sciences appliquées telles que la science médicale et la science animale. Le Dr Chihiro Emori, professeur adjoint, et le Dr Manabu Ozawa, professeur agrégé de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir préparé le fibroblaste embryonnaire de souris, préparez le plat de culture cellulaire recouvert de gélatine comme décrit dans le manuscrit et incuberez-le pendant deux heures dans un incubateur humide.
Retirez la solution de gélatine, lavez le plat deux fois avec du PBS et conservez-le à température ambiante jusqu’à utilisation. Décongeler le stock de MEF congelé inactivé mitotiquement à l’aide d’un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant une minute. Un jour avant l’ensemencement de l’ESC, placer le MEF sur une capsule de 60 millimètres recouverte de gélatine.
Décongeler un tube de stockage d’ESC congelé comme indiqué précédemment et placer une fois 10 à la cinquième CSE sur une boîte de 60 millimètres contenant du MEF pré-ensemencé. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu de culture ESC et incuber la capsule jusqu’à ce que l’ESC atteigne 50 à 70% de confluence. Après avoir lavé l’ESC cultivé avec quatre millilitres de PBS, digérez-les avec 800 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.
Une fois que la trypsine est inactivée avec un millilitre d’ESCM, ajoutez un millilitre d’ESCM frais aux cellules, transférez le milieu dans un tube et granulez les cellules par centrifugation à 280 G pendant cinq minutes. Après avoir remis les cellules en suspension dans un millilitre d’ESCM frais, compter la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleu trypan. Après avoir transféré une fois 10 au cinquième CES dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et les avoir lavés trois fois avec du PBS par centrifugation, remettre en suspension la pastille d’ESC dans 12 microlitres de mélange d’ADN Cas9 RNP et bien mélanger par pipetage doux pour éviter les bulles.
Ensuite, servez l’ESC suspendu pour l’électroporation. Ensuite, cultivez les CSE électroporées dans une boîte de 60 millimètres contenant quatre millilitres d’ECSM avec du MEF mitotiquement inactivé et continuez à changer le milieu quotidiennement. Trois à cinq jours après l’électroporation, laver les CES avec quatre millilitres de PBS puis les digérer avec 800 microlitres d’EDTA à 0,25% trypsine et les cultiver dans un incubateur humide.
Ensuite, ajoutez deux millilitres d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine. Une fois que le mélange de cellules est granulé, remettez le granulé en suspension dans un millilitre d’ESCM frais et comptez la concentration de la cellule à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleue de trypan. Faire passer les CSE une fois 10 à la troisième cellule par boîte de 60 millimètres contenant l’ESCM et le MEF d’alimentation.
Assurez-vous de changer le milieu jusqu’à ce que la colonie se rétablisse. Cinq à sept jours après le premier passage, une fois que l’ESCM est aspiré de la boîte de culture ESC, ajoutez quatre millilitres de PBS. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, prélevez des colonies d’ESC simples contenant cinq microlitres de PBS au stéréomicroscope.
Placer les colonies individuelles dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits contenant 15 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine. Après avoir incubé la plaque de 96 puits, arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 80 microlitres d’ESCM et en dissociant les colonies d’ESC en cellules individuelles par pipetage. Pour le génotypage par PCR, transférer 40 microlitres de suspension d’ESC dans une plaque de 96 puits sans gélatine et sans alimentation contenant 50 microlitres d’ESCM par puits.
Pour constituer le stock d’ESC congelé, transférer les 60 microlitres restants de suspension d’ESC dans un puits d’une plaque de 24 puits recouverte de gélatine contenant 500 microlitres d’ESCM et de MEF d’alimentation. Stocker des clones d’ESC individuels cultivés dans la plaque de 24 puits jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 60 à 80 % et récupérer les clones d’ESC individuels par trypsinisation, comme démontré précédemment. Après avoir obtenu la pastille cellulaire par centrifugation, remettre en suspension 500 microlitres de milieu de congélation cellulaire pour congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius.
Pour le génotypage par PCR, cultivez les clones d’ESC comme démontré précédemment et retirez l’ESCM de chaque puits par aspiration avant de le laver deux fois avec 100 microlitres de PBS. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse contenant la protéinase K et mélangez bien. Maintenant, transférez le lysat ESC dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et conservez-le dans une chambre de chaleur à 65 degrés Celsius pendant au moins une heure.
Une fois que l’ADN génomique est dissous dans 20 microlitres d’eau sans DNase, déterminez la pureté et la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Après avoir effectué la PCR génomique à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques au locus pour amplifier la région cible, vérifiez la séquence et choisissez les clones ESC avec les séquences knock-in souhaitées. Après l’accouplement des femelles traitées aux hormones avec les mâles ICR et la collecte de l’oviducte, placer les oviductes prélevés dans des gouttes FHM et récupérer les embryons au stade à deux ou quatre cellules en rinçant l’oviducte avec FHM à l’aide d’une aiguille de rinçage insérée dans l’infundibulum.
Lavez les embryons prélevés en les déplaçant dans plusieurs gouttes fraîches de MHF à l’aide d’une pipette buccale. Culture des embryons dans 50 microlitres de KSOM gouttes sur une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres recouverte d’huile minérale comme démontré précédemment pendant une journée jusqu’à ce que le stade de huit cellules ou morula soit atteint. Préparer des pipettes en verre pour maintenir les embryons et l’injection d’ESC à l’aide d’un extracteur et d’une microforge.
Après avoir intégré une pipette de maintien contenant de la MHF dans un support capillaire relié à un micro-injecteur, installez-le sur le côté gauche du micromanipulateur. Connectez une pipette d’injection à un autre micro-injecteur et installez-la sur le côté droit. Alignez les deux pipettes directement dans le champ de vision du microscope.
Faire des gouttes de cinq microlitres de pyrrolidone polyvinylique à 12% et des gouttes de cinq microlitres de FHM sur le même couvercle d’un plat de 60 millimètres, côte à côte. Couvrir les gouttes avec de l’huile minérale. Transférer les embryons dans cinq microlitres de goutte de MHF et ajouter un à cinq microlitres de suspension d’ESC à la goutte de MHF contenant des embryons.
Une fois la pipette d’injection lavée avec de la polyvinylpyrrolidone, déplacer la pipette d’injection vers la goutte contenant les embryons et les ESC. Choisissez trois doublets ESC individuels qui viennent de terminer leur division cellulaire dans la pipette d’injection. À l’aide de la pipette de maintien, tenir un embryon de stade de huit cellules ou de morula qui a terminé le compactage par aspiration et faire un trou dans la zone pellucide avec une impulsion piézoélectrique.
Expulser l’ESC à six cellules à l’intérieur de la zone pellucide et retirer la pipette des embryons. Lavez doucement les embryons injectés par l’ESC avec plusieurs gouttes de KSOM à l’aide d’une pipette buccale et incuber dans une nouvelle goutte KSOM de 50 microlitres recouverte d’huile minérale, comme démontré précédemment, jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de blastocyste. Un amplicon PCR de taille spécifique à la cible knock-in est obtenu et 9 clones sur 22 ont montré une bande spécifique knock-in.
Ces résultats sont efficaces et reproductibles pour l’inactivation génique sans aucune sélection de médicaments. La détermination de la taille optimale des colonies d’ESC est très importante pour cette procédure. Évitez de choisir des colonies trop grandes ou trop petites.
L’édition directe du génome médiée par CRISPR Cas9 à l’aide d’un zygote serait applicable à la fabrication de souris knock-out de gènes simples. Ce protocole de ciblage du gène ESC médié par CRISPR Cas9 facilite la production de diverses souris génétiquement modifiées pour une analyse future en sciences de la vie.
