Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Préparation des médias NOTE: Le protocole repose sur l&#39;utilisation d&#39;un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1. <ol><li> Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu&#39;à ce que la solution est claire. <ol><li> Commencez par pipetage 7,2 ml de DMEM / F12, puis ajouter 1 ml de 25 mg / ml d&#39;insuline (constitué dans HCl 0,01 M) et bien mélanger en inversant le tube. Il prend quelques minutes jusqu&#39;à ce que la solution est claire. </li><li> Ajouter 1 ml de 100 mg / ml apo-transferrine (préparés dans l&#39;eau), 33 pi de 0,6 mg / ml progesternone (faites dans de l&#39;éthanol), 100 pi de 160 mg / ml (1 M) putrescine (composé dans l&#39;eau ), 10 pl de sélénite 3 mM de sodium (préparés dans l&#39;eau) et 666 ul de 7,5% d&#39;albumine de sérum bovin et bien mélanger le tube. Aliquote dans 2,5 ml et conserver à -20 °C pendant jusqu&#39;à 2 mois. </li></ol></li><li> Préparer les médias. <ol><li> Pour 250 ml de DMEM / F12 ajouter 2,5 ml de N2. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre. </li><li> Pour 250 ml de Neurobasal médias ajouter 5 ml de supplément de B27. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre. </li><li> Mélanger les médias à partir des étapes 1.2.1 et 1.2.2 dans un rapport de 1: 1. Dans certains cas, un 1: mélange 3 peut être nécessaire (complétée le mélange 1: 1 à l&#39;étape 1.2.4). </li><li> Pour le mélange ajouter 0,5 ml de L-glutamine (concentration finale 0,2 mM) et 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 0,1 mM) et bien mélanger sans agitation. Entreposer le support à 4 ° C pendant jusqu&#39;à trois semaines et ne pas exposer à la lumière. Ce mélange final est appelé N2B27. </li></ol></li><li> Préparer la solution de gélatine. <ol><li> Préparer une solution de gélatine à 1% dans de l&#39;eau ultrapure et autoclave à 121 ° C, 15 psi, pendant 15 minutes. Il est important que la bouteille utilisée pour cela est complètement propre des détergents ou des désinfectants, il est donc recommandé qu&#39;une nouvelle bouteille estutilisé pour cela et est seulement jamais rincé à l&#39;eau ultra pure entre les utilisations. Aliquoter la solution à 1% en portions de 50 ml et de garder à 4 ° C pendant des mois. </li><li> Chauffer une partie aliquote de 1% de gélatine dans un bain d&#39;eau à 37 ° jusqu&#39;à dissolution et ajouter à 500 ml de solution saline tiède tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez bien et pipette assez pour couvrir le fond de chaque puits ou d&#39;une plaque. Autoriser la gélatine pour enrober la surface pendant au moins 30 min. </li></ol></li></ol> 2. Placage des cellules NOTE: Ce protocole vaut également pour ESC de souris cultivées dans 10% de sérum avec le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), le remplacement de sérum avec un FRV ou un milieu sans sérum avec LIF et la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) ou inhibiteurs de MEK et GSK3 (médias 2i) avec ou sans FRV. Toutefois, le moment et l&#39;efficacité de la différenciation peuvent varier selon les médias et les cellules (voir la discussion). Pour les expériences présentées ici nous avons utilisé la ligne 46C souris ESC (qui a un rapporteur de l&#39;EGFP a frappé en on des allèles SOX1 endogènes), cultivés dans du GMEM avec 10% de sérum et LIF. Pour des résultats optimaux, il est important que les cellules sont dissociées et replaquées dans le milieu N2B27; changeant simplement de médias de GMEM / sérum / FRV à N2B27 aboutit toujours à une efficacité réduite par rapport à la différenciation les plaquant les cellules. <ol><li> Cultiver les cellules dans GMEM avec 10% de sérum, du pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1x, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol, et 100 unités / ml de LIF 13. Pour obtenir une culture subconfluente de souris ESC, plaque 1 x 10 6 cellules dans un flacon de culture T25 qui aura 2 - 3 jours. </li><li> Respecter les cellules sous champ lumineux microscope. Lorsque les cellules sont sous-confluente et prêt à passage, rincer deux fois dans du PBS. Ajouter 1 ml de cellules réactif de dissociation et revenir à l&#39;incubateur pendant 2 - 5 min. Bien que la trypsine et d&#39;autres enzymes peuvent également être utilisés pour la dissociation des cellules, elles peuvent avoir un impact négatif sur la fixation des cellules de sorte que les densités de placage devront être ADJUsted. </li><li> Une fois que les cellules commencent à soulever de la plaque, appuyez sur le navire pour les déloger dans une suspension cellulaire unique. Recueillir les cellules dans un total de 10 ml de médias et de dissociation cellulaire réactif et de la pipette dans un tube de 15 ml centrifugeuse. </li><li> Faites tourner les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de pré-chauffé N2B27 par aspiration et refoulement 3 - 5 fois. Lorsque la suspension pipetage vers le bas, contre le bord pipette du tube pour éviter de créer des bulles. Compter les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre et enregistrer la concentration. </li><li> Préparer une suspension de cellules contenant le nombre désiré de cellules par unité de volume à être plaqué par puits dans préchauffé N2B27. Une densité de 10 500 cellules par cm 2 dans un plat à 6 puits (par exemple, 1 x 10 5 cellules par puits d&#39;un plat à 6 puits) est optimale. Voir le tableau 1 pour suggéré nombre de cellules par cm 2 et plaTing volumes de médias pour une variété de récipients de culture cellulaire. </li><li> Aspirer la gélatine à partir de la cuve de culture et de la plaque de la suspension cellulaire en fonction de la densité et le volume suggéré dans le Tableau 1. Ne pas agiter les plaques comme cela va concentrer les cellules vers le centre. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Changer de support tous les 1 - 2 jours en remplaçant tous les médias avec N2B27 frais. Pipette doucement rinçage des cellules pourrait affecter la densité et de réduire l&#39;efficacité de la différenciation dans les jours suivants. Où viabilité initiale après l&#39;étalement est pauvre, plaque les cellules dans un 1: 3 mélange des médias N2 et B27-complétées et changer cette N2B27 après les deux premiers jours. Les cellules commencent à se différencier et doivent montrer l&#39;expression de Sox1 (visible par fluorescence verte de la journaliste dans la lignée cellulaire 46C utilisé ici) dans les 4 - 6 jours. </li></ol> 3. Coloration immunofluorescente NONTE: Le protocole peut être appliqué à n&#39;importe quel type de navire. Le volume de chaque réactif est décrite par puits de plaque de 6 puits et peut être adapté à toute surface. Réensemencement est pas recommandé en raison de la faible viabilité après. <ol><li> Retirer le milieu de différenciation et de fixer les cellules par addition de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldehyde, laisser pendant 15 minutes. </li><li> Laver et perméabiliser les cellules avec 2 ml de PBS-T (solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% (v / v) de Tween-20) à deux reprises. Les cellules peuvent être maintenues dans du PBS-T pendant jusqu&#39;à 2 mois à 4 ° C. </li><li> Remplacer PBS-T avec 1 ml de PBS-T contenant 10% (v / v) de sérum (de la même espèce que l&#39;anticorps secondaire). Incuber 1 h sur la bascule de la plaque à la température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique. </li><li> Après 1 h, laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS-T, et incuber dans 500 ul d&#39;IgG de souris contre ßlll-tubuline (dilué à 1: 1000 dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez sur la bascule de la plaque et laisser O / N à 4 ° C. </li><li> De cette étape, toujours protéger le navirede la lumière. Laver les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul d&#39;anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence (dilué à 2 pg / ml dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez-le sur la bascule de la plaque pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul de DAPI (dilué à 0,5 ug / ml dans du PBS-T) et laisser reposer pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules à nouveau et les garder dans PBS-T. Les cellules sont prêts à être photographiés et peuvent être conservés pendant un maximum de 2 semaines à 4 ° C. Notez que le signal de la GFP disparaît au fil du temps il est donc inapproprié de comparer l&#39;intensité de la GFP de cellules fixes et vivants ou des cellules fixées à des moments différents. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li><li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d&#39;une décennie 6. Le protocole est très efficace, composée d&#39;un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l&#39;efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle. <p clas...

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l&#39;embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d&#39;une chimère), l&#39;injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés 1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d&#39;agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l&#39;acide rétinoïque morphogène 2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones 5. Beaucoup utilisent encore l&#39;agrégation, d&#39;autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l&#39;utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d&#39;une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé. Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum 6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l&#39;efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques 6). Néanmoins, il ya des défis à l&#39;application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d&#39;alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l&#39;une des étapes les plus importantes pour l&#39;application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l&#39;un des signaux induisant (FGF4 11) exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV 12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, serum free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Reconstitute with sterile 0.01M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Reconstitute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin fraction V</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukaemia inhibitory factor</td>
			<td colspan="3">prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l&#39;étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d&#39;étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l&#39;aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l&#39;intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l&#39;ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l&#39;utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l&#39;optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.

Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C 14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l&#39;expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées da...

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K vues.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

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Biologie du développement

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...