Cette méthode peut aider les recherches à trouver rapidement et sans effort des périodes anormales de développement de l’embryon de tomate. Le principal avantage de ce protocole est un traitement des graines de tomate avec de l’hypochlorite de sodium qui fournit une base pour l’observation des embryons de tomates. Commencez par la préparation chimique et la récolte des fruits de Solanum lycopersicum trois à 23 jours après la floraison ou le DAF.
Mettez immédiatement les fruits sur la glace et divisez-les en fruits précoces, moyens et tardifs, en fonction des jours suivant la floraison. Casser le fruit précoce, le mettre sur une lame et recueillir soigneusement les graines fraîches avec une pince de précision sous un grossissement de 1x à 4x du stéréomicroscope. Pour les fruits moyens et tardifs, cassez les fruits et collectez directement les graines fraîches à l’aide d’une pince de précision.
Dans la méthode conventionnelle, transférer immédiatement les graines fraîchement récoltées dans un tube centrifuge de deux millilitres contenant 1,5 millilitre de fixateur FAA et placer le tube sur l’agitateur orbital à 5 tr / min pendant quatre heures à température ambiante. Déshydratez ensuite les graines à 70%95% et 100% d’éthanol pendant une heure chacune sur un agitateur orbital à 5 rpm. Une fois cela fait, placez la graine dans les trois à cinq gouttes de solution de nettoyage présentes sur la lame et recouvrez-la délicatement d’un couvercle.
Utilisez une seule lame concave pour les graines moyennes et tardives. Selon les stades de développement des graines, incuber à température ambiante pour le nettoyage. Après incubation, observez les échantillons avec un contraste d’interférence différentiel, ou un microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique à grossissement 10x, 20x et 40x.
Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images. Transférer les graines fraîches recueillies sur les fruits cassés dans un tube à centrifuger de deux millilitres contenant 1,5 millilitre de solution désinfectante. Incuber les échantillons sur un agitateur orbital à 30 rpm pendant trois à 50 minutes à température ambiante.
Une fois que le contour le tégument le plus interne est clairement visible, jetez la solution désinfectante. Pour les graines moyennes et tardives, transférez les graines sur une lame. Utilisez une pince et une aiguille à dissection pour enlever le mucilage de la graine sous un grossissement de 1x à 4x du stéréomicroscope.
Transférez les graines dans le tube centrifuge d’origine à l’aide d’une pince. Lavez-les cinq fois dans 1,5 millilitre d’eau désionisée pendant 10 secondes chacun et jetez l’eau désionisée. Ensuite, ajoutez le double volume de la solution de défrichage aux graines.
Selon le stade de semence, administrer le traitement intermittent sous vide pendant zéro à 50 minutes, à intervalles de 10 minutes après chaque traitement sous vide de 10 minutes. Après le traitement sous vide, remplacez la solution de dégagement. Pour faciliter l’élimination des graines, placez le tube centrifuge à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à sept jours à température ambiante.
Dans le cas d’embryons tardifs, remplacer la solution quotidiennement par une solution de clairage fraîche, puis soumettre les graines à un traitement sous vide pendant 10 minutes. Placez les graines dégagées sur la lame ou sur la lame concave unique. À l’aide du microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique, ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez l’image.
Dans la méthode conventionnelle d’élimination des graines de S. lycopersicum, les cellules endospermes denses bloquaient la visualisation des embryons précoces à 3 et 6 DAF. La diminution de la perméabilité pendant la croissance des graines a entraîné des images floues après 9 DAF. Le mucilage et le tégument des graines se sont progressivement densifiés, empêchant la pénétration des agents de défrichement à partir de 13 DAF.
Le contour de l’embryon à l’intérieur de 14 à 19 graines DAF était extrêmement flou, malgré la durée prolongée du traitement de sept jours. La structure interne de 22 graines DAF était complètement invisible. Le mucilage du tégument dénudé produit par les cellules épidermiques du tégument était proéminent à partir de 13 DAF.
Le traitement à l’hypochlorite de sodium a permis d’identifier clairement le tégument interne et de se détacher de la majeure partie du mucilage adhérent sans endommager les graines. Dans le protocole de nettoyage optimisé, les graines ont montré une transparence satisfaisante à tous les stades de développement testés. Les couches cellulaires distinctes du tégument à 3 DAF, les cellules endospermes distinguables à 5 DAF, l’embryon en forme de bâtonnet à sept DAF, le stade globulaire à 9 DAF et le stade cardiaque à 11 DAF ont été observées.
Dans le protocole optimisé, le degré de la boucle des cotylédons et du méristème apical des pousses a été très facilement capturé à différents stades du développement embryonnaire. La stérilisation élimine le mucilage des graines et le pigment du tégument, ce qui améliore la pénétration et la visualisation des graines. Le traitement sous vide peut accélérer la pénétration de la solution de nettoyage.
