Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la barrière de testicules sanguins des champs de biologie sur les candidats génétiques, les virus ou les toxines environnementales qui peuvent affecter la fonction ou l’intégrité de barrière de testicules sanguins. Trois jours avant la chirurgie, traiter au moins trois souris mâles C57Black/6 de huit semaines par jour avec un chlorure de cadmium de poids corporel de cinq milligrammes par kilogramme par injection intraperitoneal. Le jour de la chirurgie, placez un tissu propre sur une zone chirurgicale stérilisée à 75 % d’éthanol et réglez un chauffe-eau thermostatique à 37 degrés Celsius.
Placez une souris anesthésiée sur le tissu, puis confirmez un manque de réponse au pincement des pieds. Raser les poils abdominaux avec un rasoir, et désinfecter la peau exposée avec 75% d’éthanol. Faire une incision cutanée d’un centimètre au-dessus des glandes préputiales pour exposer la paroi abdominale, et utiliser de petits forceps pour soulever la peau pour faire une incision de 0,5 centimètre dans le péritoine.
Utilisez les forceps pour rechercher des tampons de graisse autour de l’épididyme et des testicules, tirant soigneusement les tampons de graisse dehors pour exposer un testicules attaché. Placez un morceau de papier de neuf centimètres sous les tampons gras et les testicules, et chargez une pipette de microinjection avec la solution inuline-FITC fraîchement préparée. Connectez la pipette à une unité de micromanipulateur, et utilisez un microscope disséquant pour insérer doucement la pointe de pipette de microinjection sous l’albuginea de tunica.
Faites pivoter lentement le levier de fonctionnement pour livrer 20 microlitres de l’inuline-FITC dans l’interstitium du testicules. Si la livraison est réussie, les testicules tourneront une couleur vert-jaune vif. Retourner immédiatement les testicules dans la cavité abdominale, et injecter le testicules contralatéraux avec 20 microlitres de PBS, puis fermer la peau avec une suture chirurgicale.
Et placez la souris sur le coussin chauffant d’un radiateur thermostatique. 40 minutes après l’injection, utilisez des ciseaux pointus pour recueillir les testicules de chaque souris et lavez les tissus en un millilitre de PBS glacé. Ensuite, fixez les testicules en paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures, suivis de trois lavages en 1,5 millilitres de 1 % de PBS par lavage.
Après une déshydratation de 30 % du saccharose pendant la nuit, transférez les échantillons dans des cadres d’intégration individuels et couvrez les tissus d’un composé optimal de température de coupe. Réglez la température d’un cryostat à 20 degrés Celsius négatif et placez les cadres dans le cryostat pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que l’OCT soit gelé. Ensuite, remplissez chaque cadre d’intégration avec oct frais jusqu’à ce que l’ensemble des testicules est couvert dans chaque moule.
Lorsque la deuxième couche d’OCT est gelée, acquérir une section transversale de cinq micromètres d’épaisseur de chaque testicules, capturant les sections tissulaires sur des diapositives de microscope en verre au fur et à mesure qu’elles sont obtenues. Pour l’image des échantillons, réchauffez d’abord les glissières dans une boîte humidifiée à température ambiante. Après 10 minutes, laver les glissières trois fois dans une solution saline fraîche tamponnée par lavage et laisser sécher les sections pendant cinq minutes à l’abri de la lumière.
Utilisez du papier sans poussière pour enlever toute solution saline résiduelle et montez les échantillons à l’aide d’un support de montage complété par dapi. Ensuite, couvrez chaque échantillon d’un glissement de couverture inversé et imagez les échantillons sous l’objectif 20X d’un microscope confocal. Trois jours de traitement au chlorure de cadmium causent des dommages à la barrière de testicules sanguins permettant la diffusion de l’inuline-FITC du compartiment basal au compartiment apical de l’épithélium séminifère.
En revanche, cette diffusion est bloquée dans le contrôle des testicules traités par PBS. L’étendue des dommages causés par la barrière de testicule sanguin est déterminée en calculant le rapport entre la distance de diffusion inuline-FITC et le rayon du même tubule séminifère. En outre, la barrière intacte de blood-testis dans les souris floxed hétérozygous Rictor de KO bloque la diffusion d’inuline à travers la barrière dans le compartiment apical, alors que les souris conditionnelles de KO de Rictor possèdent une barrière compromise de blood-testis qui permet la diffusion d’inuline.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de livrer inulin-FITC préparé le jour de l’expérience et de garder le tissu protégé de la lumière puisque fitc est une molécule sensible à la lumière. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de spermatogenèse altérée parce que la fonction de la barrière de blood-testis est de fournir un microenvironnement immunisé-privilégié pour l’accomplissement de la méiose dans le spermatogenèse. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la médecine de la reproduction d’explorer la sous-fertilité et l’infertilité chez la souris.
N’oubliez pas que le travail avec des paraformaldéhydes peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de vêtements et de masques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
