L’analyse des fibres d’ADN nous permet de comprendre l’impact des nanomatériaux sur l’ADN au niveau moléculaire. Et cette information permettra d’élaborer des stratégies qui réduiront la nanotoxicité. Cette technique nous permet de comprendre la dynamique de l’ADN et son impact lorsque les cellules ou les tissus sont exposés à des agents endommageant l’ADN, exogènes ou endogènes, et nous pouvons examiner la réplication de l’ADN, la réparation de l’ADN et la dynamique de la chromatine. L’étude de la dynamique de réplication de l’ADN et du mécanisme de réparation aidera à développer des stratégies qui amélioreront l’efficacité du matériel thérapeutique ou réduiront l’effet hors cible de la nanomédecine.
Ce que nous voulons vraiment que les gens sachent à propos de cette technique, c’est que ce sont les différentes choses que nous pouvons ou qu’une personne peut faire. L’une consiste à comprendre comment de nouveaux agents chimiothérapeutiques peuvent avoir un impact sur la santé d’une cellule, pour voir si vous pouvez les tuer plus rapidement ou plus efficacement. La prochaine chose est de penser à quand vous ajoutez un agent, dis-le est un nouvel agent thérapeutique ou pharmaceutique, vous voulez savoir si cela va blesser une personne avant de le lui donner.
Par conséquent, vous pouvez simplement donner l’agent aux cellules ou aux systèmes modèles et voir si cela nuit aux cellules ou au système modèle, et si oui, combien? La prochaine chose est de regarder, nous développons tous ces nouveaux nanomédicaments et nous voulons nous assurer que ces nanomédicaments ne nuisent pas à une personne ou à l’endroit où nous injectons le nanomédicament. La dernière chose est parfois que vous voulez savoir comment une protéine affecte la réplication de l’ADN, la réparation de l’ADN ou la dynamique de la chromatine et nous pouvons utiliser cette technique pour pouvoir le faire.
Voici Shirali Patel, étudiante à la maîtrise en recherche en biotechnologie médicale dans mon laboratoire, qui fera la démonstration de la procédure. Commencez la préparation du dosage des fibres en retirant le milieu de 75% à 80% de cellules de macrophages RAW 264.5 confluents et en le divisant en deux moitiés. Réserver une moitié pour la réserve de pouls chloro-iododésoxyuridine ou chloro-iododésoxyuridine et ajouter cinq microlitres d’iododésoxyuridine à l’autre moitié, soit 50 micromoles comme concentration finale.
Après mélange, ajoutez le milieu contenant de l’iododésoxyuridine dans les plaques et placez les cellules dans l’incubateur pendant 20 minutes. Préchauffer le milieu de réserve chloro-iododésoxyuridine à 37 degrés Celsius et ajouter la chloro-iododésoxyuridine à ce milieu avant l’impulsion chloro-iododésoxyuridine. Après 20 minutes, aspirer le mélange de milieu iododésoxyuridine du ballon de cellules macrophages RAW 264.5.
Lavez doucement les cellules avec 500 microlitres de PBS, ayant un pH de 7,4, et tournez la plaque avant de jeter le PBS. Traiter les cellules avec diverses concentrations de nanoparticules d’oxyde de graphène dans 500 microlitres du milieu et incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirer le mélange milieu de traitement et laver doucement les cellules avec 500 microlitres de PBS en tournant doucement la plaque avant de jeter le PBS.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres de chloro-iododésoxyuridine au milieu de réserve chloro-iododésoxyuridine et couvrez les cellules avec le milieu de réserve chloro-iododésoxyuridine. Pour l’impulsion chloro-iododésoxyuridine, placez les cellules dans l’incubateur pendant 20 minutes. Après un lavage PBS, grattez les cellules pendant trois à quatre minutes, puis ajoutez cinq millilitres de milieu dans la plaque et recueillez les cellules.
Centrifuger les cellules collectées à 264G pendant quatre minutes. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS glacé. Pour préparer les fibres d’ADN, étiquetez les lames de verre avec la condition expérimentale et la date, à l’aide d’un crayon.
Aspirez deux microlitres de cellules dans une pipette et maintenez la pipette à un angle d’environ 45 degrés. Placez ensuite la pipette à environ un centimètre sous l’étiquette de la lame et déplacez la pipette horizontalement vers l’étiquette de la lame avec une libération lente de la solution cellulaire. Une fois que la solution s’évapore et semble collante et collante, superposez chaque ligne de cellules avec 15 microlitres de tampon de lyse sans laisser l’embout de la pipette toucher la lame.
Ensuite, inclinez la lame à un angle de 25 degrés et laissez l’ADN sécher à l’air pendant au moins quatre heures. Le premier jour, fixez les fibres d’ADN en immergeant les lames dans de l’acide acétique au méthanol pendant deux minutes. Le deuxième jour, placez les lames dans un support de lames en verre et incuberez-les à 20 degrés Celsius pendant au moins 24 heures.
Pour dénaturer l’ADN, préparez une chambre humidifiée et placez soigneusement les lames dans un pot Coplin contenant de l’eau désionisée, ou DI, en veillant à ce que les surfaces enduites ne touchent pas les parois du pot. Après 20 secondes d’incubation, versez l’eau. Ajouter 2,5 molaires d’acide chlorhydrique dans le pot de Coplin, en recouvrant toutes les lames.
Après 80 minutes d’incubation, donner un lavage avec PBS plus 0,1% Tween, suivi de deux lavages avec PBS pendant trois minutes chacun à température ambiante. Pour l’immunomarquage, placez les lames dans la chambre humidifiée et bloquez-les en utilisant de l’albumine sérique bovine à 5%, ou BSA, dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, couvrez les lames avec une feuille de plastique transparente.
Après le blocage, retirez le couvercle et ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps primaires le long de la longueur de la lame. Ajoutez un nouveau couvercle en plastique et attendez deux heures. Après deux heures, retirez la solution d’anticorps et rincez les lames dans un pot Coplin rempli de PBS deux fois.
Bloquez à nouveau les lames en ajoutant 200 microlitres de 5% BSA le long de la lame. Ajouter un couvercle en plastique et incuber pendant 15 minutes. Après avoir enlevé le couvercle et enlevé l’excès de BSA à l’aide d’une serviette en papier, ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaires le long de la lame et placez un nouveau couvercle en plastique.
Après une heure, retirez le bordereau de couverture, faites tomber l’excès de BSA sur une serviette en papier et lavez les lames deux fois dans PBS. Ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps tertiaires le long de la longueur de la lame et placer un nouveau couvercle en plastique. Encore une fois, ajoutez 200 microlitres de BSA à 5% le long de chaque lame et incuber pendant 15 minutes.
Après trois lavages avec du PBS, retirez l’excès de PBS et laissez-le sécher complètement. Une fois sec, ajoutez le support de montage sur la glissière et placez les lamelles de couvercle en verre sans permettre la formation de bulles. Visualisez les fibres d’ADN immunocolorées à l’aide d’un microscope immunofluorescent équipé d’une caméra, d’un objectif 60x et d’ensembles de filtres appropriés pour détecter les colorants Alexa Fluor 488 et 594.
La variation des profils de réplication après une exposition à long terme aux nanomatériaux a été déterminée en comparant les profils de réplication des cellules avant et après l’exposition aux nanoparticules d’iododésoxyuridine et de chloro-iododésoxyuridine. L’analyse des fibres d’ADN et les images d’interprétation ont révélé un modèle pour les cellules de macrophages témoins et l’ADN des macrophages traités à l’oxyde de graphène, aux nanoparticules. La variation a été observée dans le modèle des intermédiaires de réplication, montrant une augmentation des nouvelles origines sur une région différente de la même condition.
Les données concluantes sur la fibre ont été obtenues en divisant la superficie totale de la diapositive en cinq à six régions et en prenant plusieurs images de chaque région. La sélection d’environ 500 intermédiaires à partir de plusieurs lames ou conditions était idéale pour étudier la variation de la dynamique de réplication de l’ADN. L’analyse a également indiqué une augmentation des traces rouges uniquement, indiquant des déterminations et une diminution des origines nouvellement cuites dans les cellules traitées à l’oxyde de graphène par rapport au contrôle.
La qualité de la propagation des fibres d’ADN dépend de la façon dont les fibres se répartissent les unes des autres et du fait qu’elles ne se chevauchent pas. Une fois que les fibres ont été étalées et que IdU et CldU ont été colorés, il est extrêmement important de trouver les fibres d’ADN. L’une des choses que vous pouvez faire après avoir fabriqué les fibres d’ADN est, premièrement, vous pouvez regarder comment la dynamique de réplication est affectée.
Deuxièmement, vous pouvez regarder où les dommages à l’ADN sont situés par rapport aux pistes de réplication de l’ADN. Et la dernière chose est que si vous utilisez les sondes FISH, vous pouvez réellement regarder des régions spécifiques et comment elles sont touchées par ces dommages à l’ADN. Cette technique ouvre la voie au développement de médicaments de chimiothérapie, à la conception de médicaments et à la compréhension de l’impact de la réplication de l’ADN sur divers types de protéines.
