Ce protocole pour déterminer la taille des couvées et la viabilité embryonnaire est utilisé par de nombreux laboratoires de C. elegans. La diminution de la taille brute et de la viabilité embryonnaire peut indiquer des défauts dans des processus de développement importants tels que le myosis, la fécondation et l’embryogenèse. Cette technique fournit des instructions claires pour les chercheurs novices de C.elegans.
Il est relativement simple à configurer et à exécuter, et constitue un excellent point de départ lorsque vous travaillez avec de nouvelles souches mutantes. Le plus grand défi pour cette technique est l’identification de l’embryon par rapport à l’embryon non fécondé. Les nouveaux chercheurs devraient pratiquer l’identification des embryons, des ovocytes et des différents stades larvaires avant de commencer ces expériences.
Pour commencer, étiquetez le dos de la plaque, transférez un hermaphrodite individuel de l’étage L4 vers le bas dans la plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Laissez les vers se développer en adultes et pondez leur progéniture pendant 24 heures à la température de culture standard de 20 degrés Celsius.
Marquez l’assiette le troisième jour. Le lendemain, étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez le jour un ver individuel sur la nouvelle plaque. Laissez les vers pondre des embryons pendant 24 heures à 20 degrés Celsius.
Marquez l’assiette le quatrième jour. Le troisième jour, étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez les vers individuels du deuxième jour sur la nouvelle assiette. Laissez les vers pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés.
Marquez la plaque le cinquième jour. Dessinez un motif de grille sur un couvercle de 35 millimètres à l’aide d’un marqueur fin. Placez le couvercle quadrillé sous la plaque d’essai pour le comptage afin de garder une trace des vers précédemment comptés.
À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos dans le carré individuel. Pour les vers sur les bordures carrées, comptez en fonction de l’emplacement de la tête du ver. Comptez les vers dont la tête touche les bords supérieur et gauche du carré.
Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Le quatrième jour, marquez la plaque du deuxième jour en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le cinquième jour, marquez la plaque du troisième jour en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, et notez-les dans un cahier de laboratoire.
Après avoir étiqueté le dos de la plaque, transférer un ver hermaphrodite L4 individuel sur la plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Transférer un seul ver mâle L4 sur la plaque contenant un L quatre hermaphrodites.
Laissez les vers s’accoupler et pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés Celsius. Marquez la plaque pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos le troisième jour. Le lendemain, étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez l’hermaphrodite et le mâle sur la nouvelle assiette.
Assurez-vous que l’hermaphrodite a atteint l’âge adulte. Laissez les hermaphrodites pondre pendant 24 heures à 20 degrés Celsius. Marquez la plaque pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos le quatrième jour.
Le troisième jour, étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez l’hermaphrodite et le mâle sur la nouvelle assiette. Laissez les vers pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés. Marquez l’assiette pour les embryons vivants par rapport aux embryons non éclos le cinquième jour.
À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos dès le premier jour de la plaque et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le quatrième jour, comptez la progéniture vivante et les embryons non éclos de la plaque du deuxième jour et notez-les dans un cahier de laboratoire. Vérifiez l’assiette du premier jour pour les hommes.
Si l’accouplement a eu lieu, le rapport génétique attendu des hermaphrodites par rapport aux mâles est de 50 à 50. Si la plaque du premier jour ne contient aucun mâle, l’accouplement entre le mâle et l’hermaphrodite n’a pas eu lieu. Jetez ce couple d’accouplement et notez l’observation dans le cahier de laboratoire.
Le cinquième jour, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos de la plaque du troisième jour et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le test de viabilité embryonnaire pour N2 a donné un pourcentage de viabilité de 98,9%, tandis que him-5 (e1490) et spo-11 (ok79) ont montré une réduction de la viabilité embryonnaire avec un pourcentage de 74,9% et 0,8% respectivement. La taille moyenne des couvées N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) a été déterminée à 217, 105 et 219 respectivement.
La reconnaissance des différents stades de développement de C.elegans est importante pour des données précises et reproductibles. Nous vous recommandons de vous familiariser avec le développement des vers à l’aide d’images et d’un microscope à dissection. Cette procédure est une excellente première étape pour déterminer si un gène est impliqué dans un processus de développement et peut être suivie d’analyses cytologiques pour déterminer quel processus est perturbé.
