Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé

Ce protocole génère des souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé. Il comprend une technique chirurgicale pour administrer en toute sécurité AAV dans la graisse brune. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut rapidement générer des knockouts spécifiques aux tissus sans avoir besoin d’élever des souris de manière sélective.

L’approche de fabrication de knock-out ou de knockdowns spécifiques aux tissus peut être adaptée à d’autres tissus si la procédure chirurgicale d’injection d’AAV est modifiée en fonction de l’organe cible. Pour commencer, administrer l’analgésique par voie sous-cutanée à la souris UCP1 Cre Cas9 anesthésiée afin de minimiser et de prévenir la douleur et la détresse postopératoires. Ensuite, rasez la fourrure sur sa zone interscapulaire à l’aide d’un rasoir et stérilisez la zone chirurgicale avec au moins trois tours alternés d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine, suivi d’éthanol à 70%.

À l’aide d’un scalpel, faites une incision de deux centimètres dans la peau au-dessus du tissu adipeux brun entre les omoplates pour exposer la graisse interscapulaire. Après avoir fait une seule incision, coupez les tissus adipeux à la frontière entre la région distale des tissus adipeux et des muscles. Ensuite, à l’aide des ciseaux chirurgicaux dans la main dominante, décollez les tissus adipeux brusquement et verticalement pour exposer le tissu adipeux brun tout en pinçant les tissus adipeux, y compris le tissu adipeux brun, avec la main non dominante.

Utilisez la veine de Sulzer comme point de repère pour indiquer l’emplacement précis du tissu adipeux brun. Ensuite, pour chaque souris, injectez lentement 20 microlitres de virus adéno-associé ou AAV dans chaque lobe des deux tissus adipeux bruns à l’aide d’une aiguille tranchante de calibre 32 reliée à une seringue Hamilton de 100 microlitres. Confirmer la réussite de l’injection indiquée par l’absence de fuites du site d’injection pendant l’administration d’AAV.

Après avoir assuré l’homéostasie, replacez les tissus adipeux exposés dans leur position normale pour suturer le bord des tissus adipeux et du muscle à l’aide d’un fil monofilament résorbable 5-0. Enfin, suturer la peau ouverte avec des fils tressés VICRYL non teints 5-0. L’emplacement précis du tissu adipeux brun ne peut être identifié sans l’exposer, mais une exposition excessive endommage le tissu.

Les défauts potentiels qui peuvent avoir conduit à des injections infructueuses comprenaient l’injection de la solution AAV dans la mauvaise région, la pénétration de l’aiguille à travers le tissu et le gonflement tissulaire dû à un volume excessif de la solution AAV. L’administration précise de l’ARN guide unique AAV au tissu adipeux brun a été cruciale pour le succès du protocole. La clé du succès lors de l’exposition du tissu adipeux brun est la technique de ciseaux chirurgicaux, y compris la direction et la profondeur des ciseaux, et l’emplacement de la seringue Hamilton.

Cette technique a un tissu générateur de charge spécifique aux animaux knockout pour comprendre les régulateurs moléculaires du métabolisme énergétique lié à la graisse brune.