Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui souhaitent développer des méthodes de production et de purification de l’AAV à l’aide du système de culture cellulaire baculovirus-insectes. La production d’AAV à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insectes est une méthode rentable, facile à mettre à l’échelle et compatible avec les bonnes pratiques de fabrication actuelles. Certaines parties du protocole seront démontrées par Alan Heizer, un assistant de recherche de mon laboratoire.
Commencez par décongeler un flacon de cellules Sf9 et ensemencez-les immédiatement dans 15 millilitres de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultivez des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr / min et 28 degrés Celsius dans des flacons à fond rond avec un capuchon lâche pour l’échange d’air. Propager les cellules dans une fiole d’un litre contenant 200 millilitres de milieu pour obtenir suffisamment de cellules pour la production de cellules TIPS.
Ajouter 50 millilitres de cellules Sf9 à 2 fois 10 aux 6ème cellules de puissance par millilitre dans deux flacons. Infecter une fiole de cellules Sf9 avec 0,5 millilitre de baculovirus-AAV2-GFP, et l’autre fiole de cellules avec 0,5 millilitre de baculovirus-AAV2-rep-capuchon. Trois jours plus tard, récoltez une petite aliquote de cellules Sf9 infectées par le baculovirus, également connues sous le nom de cellules TIPS.
Colorez 2 fois 10 à la 5ème puissance des cellules Sf9 non infectées et infectées par le baculovirus avec 0,5 microgramme d’anticorps anti-baculovirus gp64 de souris contenant un colorant fluorescent dans 100 microlitres de tampon bloquant pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir lavé les cellules avec du PBS pour éliminer l’anticorps, remettez en suspension les cellules colorées dans 300 microlitres de PBS contenant 0,5 albumine sérique bovine. Analyser l’expression du baculovirus gp64 sur les cellules à l’aide de la cytométrie en flux.
Lorsque les cellules sont viables à 80 à 90%, avec une augmentation du diamètre, récoltez les cellules et cryoconservez 1 fois 10 à la 7ème puissance des cellules dans un millilitre de milieu de culture d’insectes, supplanté par 10% de sérum bovin fœtal et 10% de diméthylsulfoxyde dans un récipient à congélation lente à 80 degrés Celsius négatifs. Le lendemain, transférez le tube contenant des cellules TIPS dans un congélateur à azote liquide pour un stockage à long terme. Cultiver et cultiver des cellules Sf9 naïves à 2 fois 10 à la 6ème cellule de puissance par millilitre à 28 degrés Celsius dans plusieurs flacons de deux litres contenant 400 millilitres de milieu de culture cellulaire d’insectes dans un incubateur shaker nécessaire à la production de virus adéno-associé ou d’AAV.
Après trois à quatre jours, la densité cellulaire est augmentée jusqu’à 5 à 6 fois 10 à la 6ème puissance des cellules par millilitre. Pour la production d’AAV dans des flacons dans un incubateur à agitateur orbital, utilisez une pipette ou une pompe péristaltique pour ensemencer 400 millilitres de culture Sf9 à 2 fois 10 à la 6ème pile de puissance par millilitre dans une fiole de deux litres, de manière aseptique. Installez le secoueur orbital à 125 tr / min et 28 degrés Celsius.
Décongeler un flacon de chaque cellule TIPS baculovirus-AAV-GFP et baculovirus-AAV-rep-capuchon. Diluer les cellules avec 20 millilitres de milieu de culture d’insectes et effectuer un comptage de viabilité des cellules à l’aide de bleu de trypan. Inoculer les deux cellules TIPS dans un rapport de 1 à 10 000 par rapport aux cellules Naïves Sf9 cultivées dans une fiole agitatrice ou un bioréacteur.
Le deuxième jour, récoltez un millilitre de culture Sf9 de manière aseptique et colorez avec le colorant bleu trypan pour analyser le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Le troisième jour, répétez les étapes effectuées le deuxième jour et vérifiez l’état de l’infection à baculovirus après avoir coloré les cellules Sf9. Le cinquième jour, répétez les étapes effectuées le deuxième jour, puis récoltez le milieu de culture et les cellules lorsque la viabilité de Sf9 a diminué à environ 50% Collectez le surnageant et la pastille cellulaire après la filature, et stockez-les à 80 degrés Celsius négatifs.
Une fois que la pastille de cellule productrice d’AAV est décongelée, ajoutez-y un tampon de lyse cellulaire et mélangez vigoureusement. Incuber la pastille en suspension pendant 30 minutes à température ambiante pour libérer les particules AAV. Après centrifugation, transférer le lysat cellulaire dans un nouveau récipient.
Mélanger le lysat cellulaire et le surnageant de culture cellulaire après décongélation. Ajouter 20 unités par millilitre de nucléase et du chlorure de magnésium de 10 millimolaires au lysat cellulaire pour digérer l’ADN et l’ARN, et incuber pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius. Filtrer le lysat à travers un système de double filtration en polyéthersulfone de 0,8 micromètre et 0,2 micromètre à l’aide d’une pompe.
Conservez le lysat de cellules clarifié à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou purifiez immédiatement l’AAV. Montez une colonne AVB Sepharose de 10 millilitres sur la machine de chromatographie et insérez le tuyau dans l’échantillon AAV, le tampon de lavage et le tampon d’élution. Insérez des tubes dans les fentes du collecteur de fractions de la machine de chromatographie pour recueillir les fractions de la solution de passage de colonne, du tampon de lavage et du tampon d’élution contenant les particules AAV.
Équilibrez la colonne AVB Sepharose avec cinq volumes de colonne de PBS à un débit de cinq millilitres par minute. Chargez le lysat de cellule filtré contenant des particules AAV sur la colonne d’affinité AVB Sepharose à l’aide de la machine de chromatographie équipée d’une pompe à échantillon. Exécutez l’échantillon à un débit de trois millilitres par minute.
Faites passer le PBS à travers la colonne à un débit de trois millilitres par minute jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette à 280 nanomètres revienne à la ligne de base et devienne stable. Éluez les particules d’AAV de la colonne AVB Sepharose avec un tampon de citrate de sodium de 50 millimolaires pH 3 à un débit de trois millilitres par minute. Diluer immédiatement le surnageant AAV avec un volume d’un cinquième de Tris HCl pH 8,0 de 500 millimolaires pour neutraliser le tampon d’élution acide contenant de l’AAV.
Cela empêche la dégradation médiée par le pH qui pourrait se produire avec un tampon d’élution acide pH 3.0. Ensuite, diluez dix fois le surnageant AAV avec du PBS, de sorte que les particules d’AAV soient dans un tampon physiologique. Conservez un millilitre d’échantillons traversant chaque colonne, un tampon de lavage et 100 microlitres du surnageant AAV élué pour évaluer la présence d’AAV par infection des cellules cibles.
Installez le système de filtration à flux tangentiel, équipé d’une cartouche à membrane de polyéthersulfone avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons pour concentrer l’AAV. Exécutez 200 millilitres de PBS pendant 10 minutes pour équilibrer le module de filtration à flux tangentiel. Chargez l’échantillon AAV en contrôlant le débit de la pompe jusqu’à ce que l’échantillon soit réduit au volume souhaité.
Diafiltrer le rétentat avec 100 millilitres de PBS. Après avoir concentré l’échantillon d’AAV au volume souhaité, prélevez l’échantillon d’AAV, filtrez-le à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,2 micromètre et aliquotez-le. Conservez ensuite l’échantillon d’AAV à 80 degrés Celsius négatifs.
La plupart des cellules Sf9 ont été infectées par le baculovirus en trois à quatre jours, en raison des multiples cycles d’infection, mis en évidence par l’expression de la glycoprotéine gp64 du baculovirus. La plupart des cellules montrent également une augmentation du diamètre. Les cellules montrent une augmentation du diamètre, un effet cytopathique, et environ la moitié des cellules meurent dans les cinq jours suivant l’infection, qui sont les signes de l’achèvement de la production d’AAV.
Un pic de protéines a été observé lors de l’élution avec un tampon acide correspondant à la fraction AAV. Les échantillons d’AAV purifiés montrent trois protéines de capside distinctes: VP1, VP2 et VP3, après SDS-PAGE et coloration à l’argent. L’étape la plus critique consiste à prélever les cellules TIPS avant la cryoconservation, lorsque la plupart des cellules sont infectées par le baculovirus, avec un nombre minimum de morts cellulaires.
Nous avons décrit la production et la purification du vecteur AAV du sérotype 2 comme modèle ici. Cependant, le protocole peut également être appliqué à d’autres sérotypes AAV.
