Les auteurs tiennent à remercier la Maize Genetics Cooperation, le Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) et Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) pour avoir fourni les stocks mutants et transgéniques, ainsi que Robert F. Baker et Alexander Jurkevich du Advanced Light Microscopy Core de l’Université de Missouri-Columbia pour leur aide en microscopie confocale. JMR a été soutenu par la bourse J. William Fulbright, le Fonds Diane P. et Robert E. Sharp et le programme de recherche sur le génome végétal de la National Science Foundation (IOS-1546873) à PM. CDTC, CMRV, EDCDP et RJRR sont soutenus par le programme de bourses d’études Ateneo College. CDTC, EDCDP et RJRR sont soutenus par la bourse de premier cycle DOST-SEI S & T. DODL est soutenu par la bourse académique du père Thomas Steinbugler SJ. RJRR est soutenu par Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Ce travail a été soutenu par l’École des sciences et de l’ingénierie et la Bibliothèque Rizal de l’Université Ateneo de Manille.

Méthodes améliorées d’imagerie des primordiums de feuilles de maïs

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Nous présentons deux méthodes de préparation des primordia des feuilles de maïs pour l’imagerie cellulaire. La première méthode (section 2 du protocole) permet de mesurer le primordium pour l’analyse transversale, tandis que la deuxième méthode (section 3 du protocole) permet de dérouler et d’aplatir le primordium pour l’analyse en montage entier. Ces méthodes facilitent l’imagerie cellulaire des PF dans les primordia24 des feuilles de maïs (comme illustré à la figure 4 et à la figure 5) et apportent des solutions simples aux défis de l’imagerie des feuilles de maïs en développement. La section 2 du protocole réduit le temps de dissection et améliore la précision de l’échantillonnage en mesurant les primordia avant la sectionnement plutôt que de se fier uniquement aux paramètres de stadification 9,16. Avec le nano-ruban disponible dans le commerce, la section 3 du protocole résout le problème de longue date de l’imagerie des primordia à feuilles entières dans le maïs. Ce protocole améliore la méthode précédente, qui utilisait des tubes de dialyse 31, et constitue une alternative beaucoup moins chère à la tomodensitométrie et à l’IRM11,32,33. Cependant, lorsqu’il s’agit de visualiser les traits anatomiques des feuilles et de produire des résultats optimaux, les deux protocoles présentent certaines limites, qui sont décrites dans le tableau 2 et sont discutées plus en détail ci-dessous.
Dans la section 2 du protocole, nous avons rencontré des difficultés à visualiser les contours cellulaires dans les sections transversales épaisses de la primordie foliaire, et la contre-coloration avec des colorants fluorescents liant la paroi cellulaire ou la membrane plasmique n’a pas donné de résultats satisfaisants. Par exemple, FM 4-64 a produit des résultats sous-optimaux par rapport au marqueur FP de la membrane plasmique, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figure 3A-D). Pour surmonter cette limitation, nous recommandons d’utiliser un vibratome pour produire des sections de tissu plus minces (~0,1 mm)58 qui permettront une imagerie en fond clair vif des contours cellulaires ou optimisant le protocole de contre-coloration 47,59.
Dans la section 3 du protocole, la principale limitation est la difficulté de monter la feuille sans déchirure, dommage ou bulles d’air, comme détaillé dans les étapes du protocole 3.2.5-3.2.6 (figure 3E-K). Étant donné que la feuille de maïs est bilatéralement symétrique, un montage en demi-feuille plutôt qu’un montage en feuille entière peut suffire pour la visualisation9. Pour ce faire, le primordium peut être coupé avec une lame de rasoir le long de l’axe longitudinal après l’avoir déroulé jusqu’à la nervure médiane, ce qui ne permet de monter que la moitié de la feuille. Une autre limitation de la section 3 du protocole est que l’épaisseur de la feuille peut limiter la résolution optique du signal fluorophore pendant l’imagerie profonde. Pour résoudre ce problème, il est possible d’utiliser une technique de nettoyage tissulaire60. Cependant, nous avons constaté que ClearSee61, un réactif de nettoyage couramment utilisé pour l’imagerie des tissus végétaux, n’est pas compatible avec le protocole car il provoque le détachement de l’échantillon et de la feuille de couverture de la bande nano. Une solution potentielle à ce problème pourrait être d’appliquer une membrane semi-perméable31 sur l’échantillon de feuille, ce qui permettrait de le traiter avec la solution de nettoyage tout en étant maintenu en place par le ruban nano. Une telle méthode permettant d’appliquer des solutions liquides sur la feuille déroulée pourrait également être utilisée pour les techniques d’hybridation in situ et d’immunolocalisation de l’ARN entier, qui ont été précédemment optimisées pour le développement d’inflorescences de maïs, mais pas pour les primordia à feuilles entières62,63.
Nous avons décrit des protocoles pour le maïs, qui a de grandes primordia foliaires même au stade des semis. D’autres espèces de graminées avec des primordies foliaires beaucoup plus petites, telles que le riz, l’orge, le blé, Setaria et Brachypodium 16,23,64,65,66, peuvent nécessiter l’utilisation d’outils de précision supplémentaires pour appliquer efficacement ces protocoles. De plus, ces protocoles n’étaient pas destinés à l’imagerie de cellules vivantes, qui capture en temps réel les processus dynamiques de formation tissulaire et de réponses cellulaires. Cependant, à mesure que les sondes fluorescentes, les technologies d’imagerie et les capacités informatiques continuent de progresser dans l’imagerie des cellules vivantes pour les plantes67, les recherches futures pourraient s’appuyer sur ces protocoles pour développer des stratégies d’imagerie de cellules vivantes adaptées aux caractéristiques uniques des primordia des feuilles de graminées.

Les cultures d’herbe sont une source majeure de nourriture et de biocarburants pour la population mondiale1, et l’amélioration de l’anatomie des feuilles a le potentiel d’augmenter leur productivité 2,3. Cependant, notre compréhension actuelle de la façon dont l’anatomie des feuilles est régulée chez les graminées est limitée4 et nécessite l’analyse des primordies foliaires, car de nombreux traits anatomiques et physiologiques de la feuille sont prédéterminés au début du développement 5,6,7. Les techniques d’imagerie cellulaire, telles que la fluorescence et l’imagerie confocale, sont indispensables pour étudier l’anatomie des feuilles de graminées et les traits cellulaires, mais ces techniques sont difficiles à appliquer aux primordia des feuilles de graminées car elles sont profondément gainées et roulées dans le verticille des feuilles. Nous avons abordé cette question en développant des méthodes de préparation de coupes transversales et de supports de feuilles entières déroulées pour la fluorescence et l’analyse confocale des primordia des feuilles de maïs, un système modèle pour étudier l’anatomie et le développement des feuilles de graminées 2,8.
La feuille de maïs, comme toutes les feuilles de graminées, se compose d’un limbe en forme de lanière avec une gaine qui s’enroule autour de la tige et développe la pousse 9,10,11,12,13. Les feuilles se développent à partir du méristème apical de la pousse (SAM) selon un motif distique, où chaque nouvelle feuille commence dans la position opposée à la feuille précédente, ce qui donne deux rangées de feuilles le long de l’axe vertical (Figure 1A)14 . Le stade de développement de chaque primordium foliaire est identifié par sa position par rapport à la SAM, avec le primordium le plus proche désigné comme plastochron1 (P1) et les primordia suivants désignés comme P2, P3, et ainsi de suite (Figure 1B,C)2. Au cours du développement (figure 1D), le primordium foliaire apparaît d’abord comme un contrefort en forme de croissant autour de la base de la SAM (P1), puis se développe en un primordium en forme de capuchon qui s’étend sur le méristème (P2)9,10,11. Les marges basales de la capuche se dilatent ensuite latéralement et se chevauchent à mesure que la pointe se développe vers le haut, formant un primordium en forme de cône (P3-P5)10. Le primordium croît alors rapidement en longueur, et la limite gaine-lame à la base devient plus proéminente avec la formation du ligule, la projection en forme de frange sur le côté adaxial de la feuille (P6/P7). Enfin, la feuille se déroule lorsqu’elle émerge du verticille pendant la croissance à l’état d’équilibre, dans laquelle les cellules en division sont restreintes dans la petite région basale du limbe, formant un gradient avec des cellules en expansion et en différenciation le long de l’axe proximal-distal (P7/P8)15. Le sommet des pousses d’un semis de maïs contient plusieurs primordia à différents stades de développement, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier le développement des feuilles8.
Une analyse précise du développement précoce des feuilles nécessite la stadification ou l’utilisation de critères normalisés pour définir les stades distincts du développement du primordium par rapport à d’autres paramètres de croissance ou morphologiques. Parce que les primordia foliaires sont cachés dans la pousse de graminée, les chercheurs utilisent généralement des paramètres tels que l’âge de la plante ou la taille des feuilles émergentes comme prédicteurs des stades et des tailles des primordia des feuilles 9,16. Dans le maïs, l’âge chronologique de la plante est déterminé soit par le nombre de jours après la plantation, soit par la germination (DAP/DAG)17,18. Le stade végétatif (stade V) est déterminé par la feuille supérieure avec un collet visible, une ligne pâle sur la face abaxiale entre le limbe et la gaine qui correspond à la position de la ligule et des oreillettes, une paire de régions cunéiformes à la base du limbe (Figure 1A,B)17,19 . Entre 20 et 25 DAG, le SAM se transforme en méristème d’inflorescence et cesse de produire de nouvellesfeuilles20. Les taux de croissance des primordia des feuilles de maïs peuvent varier en fonction de l’environnement et du génotype de la plante. Pour cette raison, l’âge des plantes et la taille des feuilles émergentes ne peuvent pas prédire avec précision la taille des primordia foliaires; Cependant, l’utilisation de ces paramètres peut aider à prédire la gamme des stades et des tailles de Primordia à des fins expérimentales.
L’analyse de coupe transversale est une méthode populaire pour examiner l’anatomie et le développement des feuilles chez le maïs et d’autres graminées, car elle permet d’échantillonner plusieurs plastochrons dans une seule section à travers la pousse21,22,23. Cette méthode est également pratique pour l’imagerie cellulaire d’échantillons frais, car les feuilles environnantes servent d’échafaudage qui maintient les primordia foliaires en place pendant la section et le montage24. Cependant, un inconvénient de cette méthode est qu’il peut être difficile de localiser avec précision le plastochron cible et la région dans le primordium lors de la section à partir d’une pousse intacte. De plus, comme la croissance foliaire varie d’un plastochre à l’autre et le long de l’axe proximal-distal2,5, un échantillonnage imprécis pourrait entraîner une interprétation incorrecte du stade de développement et de la région du primordium dans une section donnée. Par conséquent, la mise au point d’une méthode d’échantillonnage transversal précis des coupes transversales est essentielle pour assurer la précision et la reproductibilité des analyses anatomiques et développementales des primordia des feuilles de graminées.
L’analyse du montage des feuilles entières permet l’étude complète et intégrative des processus tissulaires et cellulaires qui se produisent à l’échelle de l’organe entier, tels que la croissance proliférative25 et la structuration veineuse26,27,28. La méthode fournit une vue d’ensemble paradermique de la feuille, permettant la découverte de processus et de modèles distincts qui seraient autrement difficiles à détecter à l’aide de l’analyse de coupe transversale24,27. Contrairement à Arabidopsis, où il existe déjà des méthodes établies pour l’imagerie des montures de feuilles entières29,30, il n’existe actuellement aucune méthode standard pour l’imagerie des montures de feuilles entières déroulées dans les graminées. Un protocole précédent de déroulement des primordia isolées des feuilles de maïs impliquait des matériaux inhabituels et ne convenait pas à l’imagerie cellulaire31. Les techniques d’imagerie avancées, telles que la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), peuvent acquérir des informations anatomiques 3D sans isoler et dérouler les primordia 11,32,33, mais elles sont coûteuses et nécessitent un équipement spécialisé. La mise au point d’une technique permettant de surmonter les contraintes imposées par la morphologie enroulée et conique des primordia foliaires du maïs et d’autres graminées ferait progresser les recherches sur leurs traits anatomiques et développementaux.
Ici, nous présentons des méthodes de préparation de coupes transversales et de montures entières de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale. Nous avons utilisé ces méthodes pour quantifier le nombre de veines et cartographier la distribution hormonologique spatio-temporelle chez les primordia des feuilles de maïs avec des protéines fluorescentes (FP)24. La première méthode consiste à enlever la partie supérieure des feuilles plus âgées des semis de maïs à l’aide d’un décapant métallique (figure 1E). En exposant l’extrémité du primordium (P5-P7), il devient possible de déterminer sa longueur sans avoir à enlever complètement les feuilles environnantes plus anciennes, permettant ainsi une section facile et précise. La deuxième méthode consiste à dérouler et à monter des primordia à feuilles entières (P3-P7) avec du ruban nano transparent double face (Figure 1F). Ces méthodes conviennent à la visualisation de divers PC24, mais nécessitent une optimisation pour l’utilisation de colorants fluorescents et de réactifs d’élimination. En outre, nous décrivons certaines procédures pour aplatir les piles z, assembler des images et fusionner des canaux dans ImageJ/FIJI34, qui s’appliquent aux images produites par les deux méthodes. Ces méthodes sont utiles pour la fluorescence de routine ou l’imagerie confocale des feuilles de maïs, mais elles peuvent également être adaptées à d’autres espèces de graminées modèles, telles que le riz, le setaria et le brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figure 1: Organisation et morphologie des primordia des feuilles de maïs et aperçu des méthodes . (A) Représentation schématique d’un plant de maïs. Le maïs a une phyllotaxie distique, la nouvelle feuille commençant à la position opposée de la feuille précédente. Le numéro de feuille indique l’ordre chronologique dans lequel les feuilles ont émergé de la germination (c.-à-d. première feuille, L1; deuxième feuille, L2; troisième feuille, L3; etc.). Chaque feuille a un limbe distal et une gaine basale délimitée par un collier qui correspond à la ligule et à l’oreillette. La feuille supérieure avec le collier visible indique le stade végétatif. Le semis dans cet exemple est au stade V2, avec le collier L2 (pointe de flèche) visible. L’icône en forme de ciseaux indique l’emplacement au niveau du mésocotyle (me) où le semis doit être coupé pour être collecté. (B) Représentation schématique de la pousse disséquée montrant L1 à L4 isolée, avec les primordia foliaires L5 à L9 montrées sous forme d’image agrandie en (C). Le nombre de plastochron indique la position du primordium par rapport au SAM, avec le primordium foliaire le plus jeune (P1) le plus proche du SAM et le primordia foliaire plus âgé (P2, P3, P4, etc.) successivementplus loin 2. (D) Représentation schématique de la morphologie des primordia des feuilles de maïs de P1 à P5. E) Vue d’ensemble schématique de la méthode d’analyse transversale de la coupe transversale des primordia des feuilles de maïs. (1) Couper les feuilles plus âgées avec un dénudeur métallique. (2) Mesurer le primordium et couper la pousse. (3) Montez la section sur une lame pour l’imagerie et le traitement (4, 5). (F) Aperçu schématique de la méthode d’analyse en montage entier des primordia des feuilles de maïs. (1) Enlevez les feuilles environnantes pour extraire le primordium. (2) Couper et dérouler le primordium à plat sur le ruban nano. (3) Monter l’échantillon pour l’imagerie et le traitement (4, 5). Abréviations : L = feuille; bl = lame; sh = gaine; co = collier; moi = mésocotyle; V = végétatif; P = plastochron; SAM = méristème apical de pousse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

Chez le maïs (Zea mays) et d’autres graminées (Poaceae), les primordia foliaires sont profondément gainées et roulées dans le verticille des feuilles, ce qui rend difficile l’étude du développement précoce des feuilles. Ici, nous décrivons les méthodes de préparation des coupes transversales et des montures entières déroulées de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale. La première méthode utilise un dénudeur de fil pour enlever les parties supérieures des feuilles plus âgées, exposant l’extrémité du primordium foliaire et permettant sa mesure pour un échantillonnage transversal plus précis. La deuxième méthode utilise un ruban nano transparent double face pour dérouler et monter des primordia à feuilles entières pour l’imagerie. Nous montrons l’utilité des deux méthodes pour visualiser et analyser les rapporteurs de protéines fluorescentes dans le maïs. Ces méthodes apportent une solution aux défis posés par la morphologie distinctive des primordia des feuilles de maïs et seront utiles pour visualiser et quantifier les traits anatomiques et de développement des feuilles chez le maïs et d’autres espèces de graminées.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Pleins feux sur l’auteur : Méthodes améliorées pour la préparation de coupes transversales et de montages entiers de primordiums de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale  

Méthodes améliorées de préparation de sections transversales et de montures entières déroulées de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale

Analyse transversale de la primordia des feuilles de maïs Nous avons utilisé la section 2 du protocole pour quantifier le nombre de veines et caractériser les profils de réponse hormonale dans les sections transversales de primordia des feuilles de maïs avec des PF (Figure 4)24. Pour évaluer le rôle de l’hormone végétale auxine dans la croissance des feuilles et la formation des veines, nous avons quantifié le nombre de nervures dans la primordie foliaire d’un mutant du maïs déficient en auxine, le gland en voie de disparition254. Chez les premiers plastochrons, les veines en développement présentent une cellularisation distincte dans la couche cellulaire médiane de la feuille de maïs primordium21,22. Cependant, l’identification et le comptage des veines à l’aide de techniques histologiques conventionnelles22 peuvent être laborieux et prendre beaucoup de temps. Ainsi, pour quantifier les veines, nous avons utilisé le marqueur de la protéine d’efflux d’auxine de maïs p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP ci-après), qui marque les veines en développement et les brins procambiaux (PCS; Figure 4A). À l’aide de la section 2 du protocole, nous avons pu normaliser l’échantillonnage de la section transversale en mesurant les primordia avant la section (Figure 4B, C). Nous avons découvert une tendance dans laquelle vt2 a un primordium plus large et plus de nervures que la normale (Figure 4D,E)24, ce qui est cohérent avec les données des feuilles complètement expansées55, indiquant que le défaut de vt2 a commencé tôt dans le développement des feuilles. En utilisant la section 2 du protocole, nous avons également pu examiner systématiquement les profils d’expression des rapporteurs de réponse hormonale PF dans les primordia foliaires (voir les exemples des images de la figure 4F-I). Grâce à un schéma d’échantillonnage de coupe transversale standardisé, nous avons cartographié la distribution des réponses auxines, cytokinines (CK) et acide gibbérellique (GA) dans différents plastochrons et régions des primordia foliaires, et découvert de nouveaux modèles de réponse qui, selon nous, ont des implications pour la croissance des feuilles et la formation des veines24. Par conséquent, ces résultats représentatifs démontrent l’utilité de la section 2 du protocole pour l’analyse transversale de la primordie des feuilles de maïs.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figure 4 : Résultats représentatifs de l’analyse transversale de la primordie des feuilles de maïs. (A-E) Quantification du nombre de veines et de la largeur du primordium dans les primordia foliaires des glands normaux et en voie de disparition2 avec le marqueur de la protéine d’efflux d’auxine PIN1a-YFP. (A) Images de fluorescence représentatives de coupes transversales de P5 à P7 exprimant PIN1a-YFP dans les veines en développement et les brins procambiaux. Les coupes transversales ont été imagées avec un microscope à épifluorescence à l’aide d’un filtre FITC (excitation 495-519 nm). Le nombre de veines et la largeur du primordium ont été quantifiés à l’aide des outils de ligne multipoint et à main levée de FIJI/ImageJ, respectivement. (B) Un plant de maïs dont les verticilles supérieurs des feuilles ont été enlevés à l’aide d’un décapant métallique pour exposer l’extrémité de la quatrième feuille (L4). La parenthèse couvre la longueur projetée du primordium, la ligne pointillée indiquant la longueur médiane. (C) Diagramme schématique de différentes formes de primordium de P5 à P7, illustrant comment le nombre de veines et la largeur du primordium à mi-longueur (ligne pointillée horizontale) peuvent varier en fonction du stade de développement du primordium. (D, E) Mesure de la largeur du primordium (D) et du nombre de veines (E) à la section mi-longueur de L4 de normal et vt2. La courbe de tendance représente des moyennes mobiles de 10 mm de mesures ±'erreur type de la moyenne (MEB). (F-I) Images confocales représentatives de sections transversales de primordia foliaire exprimant des combinaisons de PIN1a-YFP, rapporteur de réponse auxine, DR5-RFP, rapporteur de réponse cytokinine, TCS-Tomate, marqueur sensible à l’acide gibbérellique, GAR2-YFP et mDII-Vénus, une version mutée du rapporteur d’entrée de signalisation auxine DII-Venus. Les canaux FP sont superposés au canal de fond clair dans chaque image. Barre d’échelle = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Cette figure a été modifiée et reproduite avec la permission de Robil et McSteen24. Abréviations : DAG = jours après la germination; P = plastochron; vt2 = pompon en voie de disparition2; PCS = brin procambial; YFP = protéine fluorescente jaune; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; RFP = protéine fluorescente rouge; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Vénus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Analyse en montage entier des primordia des feuilles de maïs Nous avons suivi la section 3 du protocole pour visualiser et analyser l’expression de la PF dans des supports de feuilles entières de primordia de feuilles de maïs (Figure 5). En visualisant les modèles veineux avec PIN1a-YFP, nous avons constaté que la formation de veines se produit dans l’ensemble du primordium au cours des premiers plastochrons, mais que ce processus devient restreint dans les régions proximales plus tard dans le développement (Figure 5A)24. En complément des analyses de coupe transversale, les analyses de montage de feuilles entières ont révélé des schémas de réponse hormonale spécifiques aux tissus et aux stades lors de la formation des veines24. Un exemple est le modèle d’expression du rapporteur de réponse CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), par rapport à l’expression PIN1a-YFP (Figure 5B)24. En suivant la section 3 du protocole, nous avons pu effectuer des analyses qualitatives et quantitatives de l’expression de la PF dans les primordia foliaires (Figure 5D-F; données non publiées). Nous avons examiné les profils d’expression d’un rapporteur de réponse auxine, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), et d’un marqueur sensible à GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), dans des montures de feuilles entières de mutants simples et doubles de vt2 et de plante naine3 (d3), un mutant déficienten AG 56 (Figure 5D). Nous avons également comparé les niveaux relatifs de prolifération cellulaire entre les primordia foliaires normales et vt2 en utilisant p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), qui est un marqueur de la transition G1/S dans le cycle cellulaire 57 (Figure 5E,F). Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative entre la normale et vt2, l’expression de Cyclin-D2B-YFP était cohérente avec le profil de prolifération cellulaire connu des premiers plastochrons31. Nous concluons que la section 3 du protocole est une méthode efficace pour analyser des montures entières de primordia de feuilles de maïs, qui sont difficiles à imager en raison de leur morphologie laminée.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats représentatifs de l’analyse sur support entier des primordia foliaires du maïs. (A) Images de fluorescence représentatives des primordies foliaires de 7 plantules de maïs DAG montrant des nervures en développement et des brins procambiaux, marqués par le marqueur de la protéine d’efflux d’auxine PIN1a-YFP. Les primordia P3-P6 ont été excisées de la base, déroulées et aplaties avec le côté adaxial vers le haut. Les encarts montrent des gros plans de P3 et P4. Dans P5 et P6, des lignes pointillées délimitent l’extrémité distale des zones prolifératives, où la majorité des brins procambiaux se développent et s’étendent encore. (B,C) Images confocales représentatives montrant l’expression de PIN1a-YFP et du rapporteur de la réponse cytokinine, TCS-Tomato, dans la région marginale proximale d’un primordium P5. (D) Images de fluorescence représentatives de P4 primordia montrant l’expression du rapporteur de réponse auxine, DR5-RFP, et du marqueur sensible à l’acide gibbérellique, GAR2-YFP chez les mutants normaux et simples et doubles du gland en voie de disparition2 et de la plante naine3. (E) Images confocales représentatives de P3 et/ou P4 montrant l’expression de Cyclin-D2B-YFP, un rapporteur pour la transition G1/S dans le cycle cellulaire. (F) Quantités relatives de prolifération cellulaire dans les primordies foliaires P3/P4 normales et vt2, quantifiées en mesurant la densité intégrée du signal Cyclin-D2B-YFP sur la surface du primordium à l’aide d’ImageJ/FIJI. Les barres représentent les mesures moyennes ±'erreur-type de la moyenne. Barre d’échelle = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). La figure 4A-C a été modifiée et reproduite avec la permission de Robil et McSteen24, tandis que la figure 4D-F est une donnée non publiée des auteurs. Abréviations : DAG = jours après la germination; P = plastochron; vt2 = gland en voie de disparition2; d3 = plante naine3; YFP = protéine fluorescente jaune; RFP = protéine fluorescente rouge; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cycline-D2B-YFP = pZmCycline-D2B::ZmCycline-D2B:YFP; ns = aucune différence significative; Au = unité arbitraire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Exemples de stadification du développement foliaire dans les semis de maïs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S1 : Échantillons de plantes et matériaux utilisés dans les protocoles. (A,B) Un semis de maïs 7-8 DAG dont le verticille supérieur des feuilles a été enlevé à l’aide d’un dénudeur métallique. (B) L’encart montre un gros plan de la pousse avec le primordium P6 exposé. (C-G) Pousses de plants de maïs dont les verticilles supérieurs ont été enlevés pour l’analyse transversale (C, D) et les feuilles environnantes complètement enlevées pour l’analyse de montage entier (E-G). (H) Un rouleau de gel de polyuréthane transparent double face nano ruban adhésif. (I,J) Primordium (I) de la feuille P6 et région proximale de la feuille P8 (J) déroulés et montés sur des lames de verre avec le ruban nano. (K) Une lame de verre avec une feuille de primordium déroulée montée sur la scène d’un microscope à épifluorescence. Abréviation : DAG = jours après la germination. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Les primordia des feuilles de maïs sont profondément gainées et roulées, ce qui les rend difficiles à étudier. Ici, nous présentons des méthodes de préparation de coupes transversales et de montures entières de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Les graminées comme le maïs ont des primordia foliaires qui poussent dans la pousse, ce qui les rend difficiles à étudier. Nous abordons ce problème avec des protocoles améliorés pour la préparation des sections transversales de feuilles de maïs et des montures entières pour la fluorescence et l’imagerie confocale. Le premier protocole utilise un dénudeur métallique pour couper les feuilles les plus âgées, ce qui permet de mesurer le primordium avant la section.Le deuxième protocole utilise un ruban nano transparent double face pour dérouler le primordium des feuilles entières. Ces protocoles améliorent la précision de la section transversale et permettent de dérouler les primordia foliaires, ce qui a été très difficile à réaliser en raison de leur morphologie conique roulée. Ces méthodes seront utiles pour visualiser et quantifier les traits anatomiques et développementaux des feuilles chez le maïs et d’autres graminées.Sur la base de ces méthodes, nous prévoyons de développer des stratégies d’imagerie de cellules vivantes pour répondre aux questions relatives au développement des feuilles de graminées.

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Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.9K vues.  Ateneo de Manila University. Les graminées comme le maïs ont des primordia foliaires qui poussent dans la pousse, ce qui les rend difficiles à étudier. Nous abordons ce problème avec des protocoles améliorés pour la préparation des sections transversales de feuilles de maïs et des montures entières pour la fluorescence et l’imagerie confocale. Le premier protocole utilise un dénudeur métallique pour couper les feuilles les plus âgées, ce qui permet de mesurer le primordium avant la section.Le deuxi...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Méthodes améliorées pour la préparation de coupes transversales et de montages entiers de primordiums de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.