Nous remercions Jiří Macas (Centre de biologie CAS, České Budějovice, République tchèque) pour avoir fourni la souche agrobactérienne. La plateforme Sciences des plantes du CEITEC MU est reconnue pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque avec le projet du Fonds européen de développement régional « SINGING PLANT » (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) et le projet INTER-COST LTC20004.

Induction et régénération des racines poilues médiées par Agrobacterium chez les plantes

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. 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I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucune relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Nous avons développé un protocole simple pour la transformation des racines velues et la régénération ultérieure chez B. napus et A. thaliana. Ce processus comprend l’induction de racines poilues par injection dans l’hypocotyle (B. napus) ou la tige d’inflorescence primaire (A. thaliana). La méthode d’injection de l’hypocotyle avec la souche agrobactérienne C58C1 portant un plasmide Ri a également été efficace dans la famille des Fabaceae10,11, en plus des membres des Brassicaceae présentés dans cette étude.
Une alternative à la méthode par injection est la transformation par immersion consistant en une immersion de l’explant dans une suspension bactérienne, suivie d’une co-culture de l’explant avec des agrobactéries. L’avantage de la méthode par injection par rapport à la méthode par immersion est le gain de temps par l’absence de certaines étapes du protocole : préparation de l’explantation, test du temps de co-culture, et culture sur un milieu contenant de l’hormone pour l’induction des racines velues. Bien que les deux approches soient efficaces pour l’induction des racines velues, une efficacité de transformation plus élevée a été observée chez certaines espèces avec la méthode basée sur l’injection par rapport à l’immersion dans les explants12,13. De plus, la transformation par injection est également utile pour générer des plantes composites (racines poilues transgéniques et pousses de type sauvage). Après avoir coupé les racines d’origine de la plante transformée, les racines velues soutiennent la croissance de la plante et le transgène peut être étudié dans le contexte de la plante entière.
L’étape critique de l’induction de la racine poilue consiste à injecter l’inoculum dans l’hypocotyle, ou tige d’inflorescence primaire. Les hypocotyles de B. napus sont cassables et la coupe de l’hypocotyle entier peut facilement se produire. La même chose peut être observée avec A. thaliana en raison de l’amincissement de la tige de l’inflorescence. Si une comparaison de l’efficacité de transformation de différentes espèces/cultivars est nécessaire, nous recommandons qu’une seule personne effectue toutes les expériences pour éviter l’erreur causée par la manipulation et l’habileté à injecter les plantes.
Nous avons développé un protocole efficace pour la régénération des racines poilues chez B. napus DH12075 et A. thaliana Col-0. Comme la régénération est un processus très variable, certaines modifications du protocole peuvent être appliquées à une espèce ou à un cultivar de choix. Par exemple, les pousses poilues dérivées de racines peuvent être provoquées par un rapport auxine/cytokinine différent (1 :1) chez B. oleracea14. Alternativement, la cytokinine thidiazuron peut être utilisée à la place du BAP, comme dans le cas des racines poilues de B. campestris 15.
Les insertions multiples de l’ADN-T du plasmide Ri dans le génome de la plante représentent une limitation potentielle du système de transformation et de régénération des racines poilues. Dans de tels cas, aucune plante exempte de TL/TR du plasmide Ri n’est découverte après une analyse de ségrégation des plantules T1. Ainsi, nous recommandons de générer plusieurs lignées racinaires poilues indépendantes pour chaque transgène.
Les cultures de racines velues sont un outil extrêmement puissant pour les études fonctionnelles des gènes, principalement en raison de leur établissement rapide et de leur entretien peu coûteux (aucune hormone n’est nécessaire dans les milieux de culture). Ce protocole couvre les méthodes d’induction et de régénération des racines velues chez B. napus et A. thaliana, qui peuvent être utilisées pour étudier le transgène d’intérêt directement dans les cultures de racines velues, dans le contexte de la plante entière à l’aide de plantes composites, ou après la régénération des plantes transgéniques.

La transformation des plantes est le goulot d’étranglement de toute étude génétique en biologie végétale. Une bactérie du sol, Agrobacterium tumefaciens, est largement utilisée comme moyen d’administration de gènes par trempage floral ou culture tissulaire pour générer des transformants. A. tumefaciens infecte les plantes sur un site de blessure et provoque des tumeurs dues au transfert et à l’intégration de l’ADN-T d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti) dans le génome de la plante hôte. Les souches d’A. tumefaciens modifiées avec un plasmide Ti modifié sans l’ADN T de type sauvage et un vecteur binaire avec de l’ADN T artificiel et des sites de clonage pour insérer un gène d’intérêt sont couramment utilisées comme système efficace de transformation des plantes1. Cependant, de nombreuses espèces et cultures modèles sont récalcitrantes au trempage floral ou à la régénération des plantes in vitro ou ont de longs cycles de croissance, ce qui a un impact sur l’efficacité de ce système de transformation.
Agrobacterium rhizogenes induit la formation de racines adventives, ou racines poilues, sur le site de blessure après avoir infecté une plante hôte. Comme A. tumefaciens, A. rhizogenes transfère un ADN-T d’un plasmide inducteur racinaire (Ri) au génome de la plante hôte, provoquant le développement de racines poilues transgéniques. Ce processus est contrôlé principalement par les gènes 2,3 des loci oncogéniques racinaires (rol). En utilisant des souches agrobactériennes portant à la fois le plasmide Ri et un vecteur binaire artificiel codant pour un gène d’intérêt, des cultures de racines poilues ont été utilisées pour produire des protéines recombinantes, analyser la fonction des promoteurs ou des gènes, ou modifier des génomes à l’aide de répétitions palindromiques courtes en grappes régulièrement espacées (CRISPR)/protéine associée à CRISPR 9 (Cas9)4,5,6.
Notre protocole utilise la souche transconjuguée Ti-less A. tumefaciens C58C1 portant le plasmide Ri pRiA4b7. L’ADN-T du plasmide Ri se compose de deux régions, l’ADN-T droit et l’ADN-gauche (ADN-TR et ADN-TL, respectivement), qui peuvent s’intégrer indépendamment dans le génome de la plante8. En exploitant ce système, le long processus de transformation de l’explant dans le cultivar DH12075 Brassica napus a été optimisé9. Le protocole détaillé ci-dessous permet la régénération de lignées racinaires poilues sélectionnées et l’obtention de plantes T1 porteuses du transgène d’intérêt et exemptes de gènes rol en environ 1 an. La transformation par injection de racines poilues peut être utilisée chez d’autres espèces de Brassicaceae, comme le montre la transformation d’Arabidopsis thaliana Col-0. Alors que l’hypocotyle est utilisé pour transformer B. napus, A. thaliana est injecté dans la tige primaire de l’inflorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

La transformation des racines poilues représente un outil polyvalent pour la biotechnologie végétale chez diverses espèces. L’infection par une souche d’Agrobacterium porteuse d’un plasmide inducteur de racines (Ri) induit la formation de racines poilues sur le site de blessure après le transfert de l’ADN-T du plasmide Ri dans le génome de la plante. Le protocole décrit en détail la procédure d’induction des racines poilues par injection chez Brassica napus DH12075 et Arabidopsis thaliana Col-0. Les racines poilues peuvent être utilisées pour analyser un transgène d’intérêt ou traitées pour la génération de plantes transgéniques. Le milieu de régénération contenant de la cytokinine 6-benzylaminopurine (5 mg/L) et de l’acide auxine-1-naphtalèneacétique (8 mg/L) provoque avec succès la formation de pousses chez les deux espèces. Le protocole couvre le génotypage et la sélection de régénérants et de plantes T1 pour obtenir des plantes porteuses d’un transgène d’intérêt et exemptes d’ADN-T à partir du plasmide Ri . Un processus alternatif conduisant à la formation d’une plante composite est également décrit. Dans ce cas, les racines velues sont conservées sur la pousse (à la place des racines naturelles), ce qui permet d’étudier un transgène dans les cultures de racines poilues dans le contexte de la plante entière.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation des protocoles de transformation basée sur les racines poilues pour une efficacité accrue chez les Brassicaceae

Transformation et régénération des racines velues chez Arabidopsis thaliana et Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Nous avons précédemment optimisé un protocole d’induction des racines poilues par injection chez trois cultivars de Brassica napus, à savoir DH12075, Topas DH4079 et Westar9. Pour appliquer ce protocole de transformation à l’espèce modèle A. thaliana, les tiges d’inflorescence primaires des plantules de 1 mois ont été injectées avec un inoculum agrobactérien. Des racines velues sont apparues au site d’injection après 2 à 4 semaines. Les racines velues ont été excisées et cultivées sur le milieu solide. La comparaison de la méthode chez ces deux espèces est illustrée à la figure 1.
Des lignes racinaires velues sélectionnées ont été transférées dans le milieu de régénération pour induire la formation de pousses. Chez A. thaliana, des cals jaunes ont été induits en 14 jours dans les 10 lignées racinaires poilues testées. Les premières pousses sont visibles sous forme de taches vert foncé dans les 3 semaines suivant le transfert dans le milieu de régénération (figure 2). Après 4 semaines de culture, les pousses ont recouvert les racines poilues dans 9 des 10 lignes de racines poilues (efficacité de régénération de 90%). Dans certains cas, des racines adventives ont été provoquées à partir du cal (figure 2H). Une ligne ne s’est pas régénérée même après 3 mois sur le milieu de régénération (toutes les 4 semaines, les racines poilues ont été transférées dans un milieu frais). Ainsi, l’efficacité de régénération des racines poilues d’A. thaliana ressemble à l’efficacité de B. napus DH120759.
Les régénérants des racines velues de B. napus et d’A. thaliana présentent un phénotype nain (figure 3), une caractéristique typique des plantes dérivées des racines velues2. Nous avons également observé des systèmes racinaires denses, des feuilles ridées et des changements dans la période de floraison. Ce phénotype dit de racine poilue (ou Ri) est causé par les gènes rol du plasmide Ri insérés dans le génome de la plante. L’insertion de l’ADN-T Ri et du transgène codé sur un vecteur binaire peut être indépendante ou liée. Ainsi, une analyse de ségrégation de la descendance T1 créée par autopollinisation permet d’identifier les plantes sans rol exprimant le transgène d’intérêt. Le génotypage des plantes T1 est réalisé par des amorces PCR spécifiques pour les ORF de TL et TR et le transgène d’intérêt. L’absence de contamination agrobactérienne est vérifiée par l’absence de produits PCR des amorces virC (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé de la procédure chez A. thaliana et B. napus. L’injection de l’inoculum d’Agrobacterium dans l’hypocotyle ou la tige d’inflorescence primaire induit le développement de racines velues. Les racines poilues peuvent remplacer les racines indigènes pour générer une plante composite qui sera génotypée et analysée (flèches bleues). Les racines poilues cultivées peuvent être régénérées en plantes T0, propagées en plantes T1 et génotypées (flèches vertes). Les racines velues peuvent également être sous-cultivées pour une analyse fonctionnelle (flèche noire). Des exemples de résultats de génotypage sont présentés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Figure 2 : Régénération des racines poilues chez A. thaliana. (A) Culture de racines poilues 1 jour après son transfert dans les plaques. (B, C) Les Calli se sont développés en 2 semaines de culture sur milieu de régénération. (D, E) Les primordia des pousses ont émergé après 3 semaines de culture. (G, H) Les pousses se forment après 4 semaines. (H) Des racines adventives se sont développées à partir du durillon. (C, F, I) Ligne racinaire poilue non régénérante. Les barres d’échelle représentent 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Figure 3 : Photos représentatives de plantes de type sauvage de B. napus et d’A. thaliana et de régénérants dérivés de racines velues (plantes T0). Notez le phénotype Ri des régénérants. Les barres d’échelle représentent 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Le protocole décrit l’induction des racines poilues à l’aide de tiges d’inflorescence primaires d’Arabidopsis et d’hypocotyles de Brassica napus . Les racines velues peuvent être cultivées et utilisées comme explants pour régénérer les plantes transgéniques.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Nos recherches visaient à développer un protocole pour une transformation efficace chez les Brassicaceae. En utilisant une transformation basée sur les racines des cheveux, nous avons considérablement amélioré l’efficacité de la transformation de Brassica napus, ce qui est crucial pour nos recherches. Nous avons également testé le protocole chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana.Nous avons optimisé le protocole pour les cultivars de printemps DH12075 dans Brassica napus. Le prochain défi consiste à optimiser le protocole de transformation et de régénération des cultivars d’hiver de Brassica napus, ainsi que de Brassica rapa et Brassica oleracea. Les racines velues peuvent être facilement propagées et leur croissance rapide permet une analyse rapide du gène d’intérêt peu de temps après la transformation.Par conséquent, il devient possible de régénérer sélectivement des lignes racinaires poilues spécifiques qui présentent le caractère souhaité. Par exemple, une mutation génétique introduite par CRISPR-Cas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.1K vues.  Masaryk University. Nos recherches visaient à développer un protocole pour une transformation efficace chez les Brassicaceae. En utilisant une transformation basée sur les racines des cheveux, nous avons considérablement amélioré l’efficacité de la transformation de Brassica napus, ce qui est crucial pour nos recherches. Nous avons également testé le protocole chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana.Nous avons optimisé le protocole pour les cultivars de printemps DH12075 dans Brassica na...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Optimisation des protocoles de transformation basée sur les racines poilues pour une efficacité accrue chez les Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Recherche

Biologie

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Transformation des racines poilues par Agrobacterium chez Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Méthodes de régénération et de sélection pour les régénérants DH12075 Brassica napus et les plantes T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.