Name: sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
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Avant de commencer l&#39;essai, nous avons besoin pour s&#39;assurer que les réactifs suivants sont correctement préparées: <ol><li> Un tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,5. Préparer en utilisant 11,4 mg / ml de phosphate de potassium dibasique, trihydraté dans l&#39;eau purifiée et d&#39;ajuster le pH avec HCl 1M. Cette solution est placée à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Une solution de caséine à 0,65% en poids / volume, préparé en mélangeant 6,5 mg / ml de caséine dans le tampon phosphate de potassium 50 mM. Progressivement augmenté la température de la solution en agitant doucement à 80-85 ° C pendant environ 10 minutes jusqu&#39;à obtenir une dispersion homogène est atteint. Il est très important de ne pas faire bouillir la solution. Le pH est ensuite ajusté, si nécessaire avec NaOH et HCl. </li><li> Une solution 110 mM d&#39;acide trichloracétique, préparé en diluant un stock de 01h55 6.1N avec de l&#39;eau purifiée. L&#39;acide trichloracétique est un acide fort et doit être manipulé avec soin. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, ou réactif de phénol de Folin, qui est la solution qui va réagir avec la tyrosine à générer un changement de couleur mesurables qui seront directement liés à l&#39;activité des protéases. Réactif de Folin phénol est un acide et doit être manipulé avec soin. </li><li> Une solution 500 mM Sodium Carbonate, préparés en utilisant 53 mg / ml de carbonate de sodium dans l&#39;eau purifiée anyhydrous. Une solution de diluant enzyme, qui se compose de 10 mM de tampon acétate de sodium avec de l&#39;acétate de calcium 5mM, pH 7,5, à 37 ° C. Cette solution est ce que nous utilisons pour dissoudre les échantillons solides ou protéase solutions diluées enzyme. </li><li> 1,1 mM de L-tyrosine solution stock standard. Préparé en utilisant 0,2 mg / ml de L-tyrosine dans l&#39;eau purifiée et chauffée doucement jusqu&#39;à ce que la tyrosine se dissout. Comme avec la caséine, ne pas faire bouillir cette solution. Autoriser la norme de L-tyrosine refroidir à température ambiante. Cette solution sera diluée davantage pour faire de notre courbe standard. </li><li> Solution de protéase. Immédiatement avant utilisation, dissoudre dans une solution de protéase diluant d&#39;enzyme préparée à l&#39;étape 6. </li></ol> Si nécessaire, utilisez un échantillon de protéase solide de l&#39;activité prédéterminé, qui est dissous en utilisant le diluant d&#39;enzymes à 0,1-0,2 unités / ml. Cette solution sert de contrôle positif pour le test de contrôle qualité et la validation des calculs nous allons effectuer pour déterminer l&#39;activité enzymatique. Mise en place du dosage de la protéase et des courbes standard <ol><li> Pour commencer ce test, trouver des flacons adaptés qui contiendra environ 15 ml. Pour chaque enzyme qui seront testés, 4 flacons sont nécessaires. Un flacon sera utilisé comme un blanc, et trois autres seront utilisés pour l&#39;activité de dosage de trois dilutions de la protéase. Trois dilutions sont utiles lors de la vérification des calculs finale contre l&#39;autre. <ol><li> Pour chaque série de quatre flacons, ajoutez 5 ml de notre solution de caséine à 0,65%. Qu&#39;ils s&#39;équilibrer dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant environ 5 minutes. </li><li> Ajouter des volumes variables de solution enzymatique qui sera testé à trois des fioles d&#39;échantillon de test, mais pas le vide. Mélanger en remuant et laisser incuber à 37 ° C pendant exactement dix minutes. L&#39;activité de la protéase et la libération de la tyrosine consécutifs pendant ce temps d&#39;incubation est de ce qui sera mesuré et comparé entre les échantillons de test. </li></ol></li><li> Après cette incubation de 10 minutes, ajouter les 5 ml du réactif TCA dans chaque tube pour arrêter la réaction. Ensuite, ajoutez un volume approprié de solution d&#39;enzyme dans chaque tube, même le blanc, de sorte que le volume final de solution d&#39;enzyme dans chaque tube est de 1 ml. Ceci est fait pour rendre compte de la valeur d&#39;absorption de l&#39;enzyme elle-même et pour s&#39;assurer que le volume final de chaque tube est égal. Incuber les solutions à 37 ° C pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, vous pouvez configurer votre tyrosine dilutions standard. Utilisez 6 flacons DRAM (DRAM flacons peuvent être remplacés par des tubes en polypropylène) qui peut facilement contenir 8 ml. Pour les six fioles, ajouter les 1,1 mM tyrosine solutions de stock standard avec les volumes suivants de la MLS: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Ne pas ajouter de toute norme de tyrosine à la vierge. Normes inférieures peuvent être nécessaires pour des échantillons de test impurs qui donneront changement de couleur peu. Une fois la solution de tyrosine standard a été ajouté, ajouter un volume approprié d&#39;eau purifiée pour chacune des normes pour porter le volume à 2 ml. </li><li> Après l&#39;incubation de 30 minutes, le filtre de chacune des solutions de test et le blanc en utilisant une seringue de 0,45 um polyéthersulfone filtre. La filtration est nécessaire pour éliminer toute insolubles à partir des échantillons. <ol><li> Ajouter la filtration 2 ml des échantillons de test et vierge filtrat à 4 flacons de DRAM qui peut contenir au moins 8 ml. Le même type de flacon dans lequel les normes ont été préparées peuvent être utilisées. </li><li> Pour tous les flacons contenant les normes et standards vierge, ajoutez 5 ml de carbonate de sodium. Pour de meilleurs résultats, ajouter 1 ml de réactif de Folin a tout de suite après. </li><li> Ajouter du carbonate de sodium à réglementer toute baisse de pH créé par l&#39;ajout du réactif de Folin l&#39;a. </li><li> Ajouter carbonate de sodium pour les échantillons à tester et TESvierge t. Ces solutions deviennent troubles après l&#39;ajout de carbonate de sodium. Ajouter le réactif de Folin l&#39;, qui va réagir principalement avec la tyrosine libre. </li><li> Mélangez les flacons dram par tourbillonnement et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. </li></ol> Après cette incubation, vous devriez remarquer que les normes ont une gradation de couleur en corrélation avec la quantité de tyrosine ajoutée; concentrations les plus élevées de la tyrosine sombres apparaissent. Vous pouvez également changer la couleur préavis appréciable dans nos échantillons de test. 2mls de ces solutions sont filtrées à l&#39;aide de 0,45 um polyéthersulfone filtre seringue dans des cuvettes appropriés. Maintenant que le dosage est effectué, vous pouvez procéder au spectrophotomètre pour enregistrer nos valeurs d&#39;absorbance. </li></ol> De mesurer l&#39;absorbance et de calculer l&#39;activité enzymatique <ol><li> L&#39;absorbance des échantillons est mesurée par un spectrophotomètre en utilisant une longueur d&#39;onde de 660nm. Le trajet de la lumière est réglée à 1cm. Enregistrer les valeurs d&#39;absorbance pour les normes, les standards vierge, les échantillons d&#39;essai différentes, et vierge de test. Une fois toutes les données ont été recueillies, la courbe standard peut être créé. Afin de générer la courbe, la différence d&#39;absorbance entre le blanc standard et standard doit être calculé. Il s&#39;agit de la valeur d&#39;absorbance due à la quantité de tyrosine dans les solutions standard. Après ce calcul simple, créer la courbe standard à l&#39;aide d&#39;un programme graphique pour tracer le changement d&#39;absorbance de nos normes sur l&#39;axe Y, par rapport au montant en micromoles pour chacun de nos cinq normes sur l&#39;axe X. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume de la norme Tyrosine </th><th style="text-align:center"> Tyrosine umoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Après les points de données ont été entrées, générer une ligne de meilleur ajustement et l&#39;équation de pente correspondant. Trouver le changement d&#39;absorbance dans les échantillons de test en calculant la différence entre l&#39;absorbance de l&#39;échantillon de test et l&#39;absorbance du blanc d&#39;essai. Insertion de la valeur d&#39;absorbance de l&#39;un des échantillons d&#39;essai dans l&#39;équation de pente et la résolution de se traduira par la micromoles de tyrosine libérée au cours de cette réaction protéolytique particulière. Pour obtenir de l&#39;activité de l&#39;enzyme en unités par / ml, effectuer le calcul suivant: (Umole équivalents tyrosine libérée) x (11) Unités / ml = Enzyme __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = volume total (en millilitres) de dosage 10 = Temps d&#39;essai (en minutes) selon la définition Unité 1 = Volume d&#39;enzyme (en millilitres) d&#39;enzyme utilisée 2 = Volume (en millilitres) utilisées dans la détermination colorimétrique Prenez le nombre d&#39;équivalents micromoles tyrosine libérée obtenus à partir de l&#39;équation de pente et le multiplier par le volume total de l&#39;essai dans la MLS, qui dans notre cas est 11mls. Diviser cette valeur par trois autres quantités: le temps de l&#39;essai, ce qui nous avons couru pendant 10 minutes, le volume d&#39;enzyme utilisé dans le dosage, qui était variée (nous allons utiliser 1ml), le volume de millilitres utilisés dans la détection colorimétrique, ce qui peut diffèrent en fonction de votre cuvette. Nous avons utilisé 2 ml. </li><li> Micromoles de la tyrosine, divisé par le temps en minutes rendements mesure de l&#39;activité de la protéase appelée «unités». Nous pouvons annuler les unités de mesure de volume dans le numérateur et le dénominateur, laissant un measurment de l&#39;activité enzymatique en termes d&#39;unités / ml. Afin de déterminer l&#39;activité dans un échantillon de protéase solides diluées dans du diluant d&#39;enzymes, nous divisons notre activité en unités / ml par la concentration de solides utilisés dans cet essai à l&#39;origine en mg / ml., Nous laissant avec l&#39;activité en termes d&#39;unités / mg . Unités / ml enzyme Unités / mg de solide = _____________________ mg de solide / enzyme ml </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

Nous venons de vous montrer comment analyser l&#39;activité de la protéase à l&#39;aide de Sigma test universelle activité de la protéase. En outre, ce test est utile pour s&#39;assurer que nos protéases ont déterminé avec précision l&#39;activité avant de les recevoir pour vos expériences. Comme vous l&#39;avez vu, lors de cette procédure, il est d&#39;une importance primordiale à retenir la chaleur à la fois de la caséine et des solutions de tyrosine lentement et de ne pas les faire bouillir. Aussi, il est essentiel de préparer les blancs différents pour les deux normes de votre et pour chaque échantillon d&#39;essai que vous avez.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

Les protéases casser les liaisons peptidiques. Dans le laboratoire, il est souvent nécessaire de mesurer et / ou comparer l&#39;activité des protéases. Sigma non spécifiques dosage de l&#39;activité de la protéase peut être utilisé comme une procédure normalisée pour déterminer l&#39;activité des protéases, qui est ce que nous faisons lors de nos procédures de contrôle qualité. Dans cet essai, la caséine agit comme un substrat. Lorsque la protéase nous testons digère la caséine, l&#39;acide aminé tyrosine est libéré avec d&#39;autres acides aminés et fragments peptidiques. Réactif de Folin et Ciocalteus phénol, ou Folin réagit principalement avec la tyrosine libre de produire un chromophore de couleur bleue, qui est quantifiable et mesurée comme une valeur d&#39;absorbance sur le spectrophotomètre. Le plus tyrosine qui est libérée à partir de caséine, plus les chromophores sont générés et le plus fort de l&#39;activité de la protéase. Les valeurs d&#39;absorbance généré par l&#39;activité de la protéase sont comparées à une courbe standard, qui est généré par la réaction des quantités connues de la tyrosine avec le réactif CF de corréler les changements d&#39;absorbance avec le montant de la tyrosine en micromoles. De la courbe standard de l&#39;activité de la protéase échantillons peut être déterminé en termes de parts, qui est le montant en micromoles d&#39;équivalents tyrosine libéré de la caséine par minute. Pour voir cet article en chinois, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">cliquez ici</a>

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Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Les protéases casser les liaisons peptidiques. Dans le laboratoire, il est souvent nécessaire de mesurer et / ou comparer l&#39;activité des protéases. Sigma non spécifiques dosage de l&#39;activité de la protéase peut être utilisé comme une procédure normalisée pour déterminer l&#39;activité des protéases.

Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Recherche

Biochimie

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Recherche en cancérologie

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Un dosage de clivage du Peptide Fluorogène pour dépister l’activité protéolytique : demandes de coronavirus doper l’activation de la protéine

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunologie et infection

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

Détection directe des isolévuglandines dans les tissus à l’aide d’une protéine de fusion phosphatase alcaline D11 scFv et d’une immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

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