Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

המיקרומניפולציה בתאי שמרים דרוש ניתוח גנטי meiotic או לבחור zygotes דיפלואידי. Micromanipulations אלה מתבצעות באמצעות microneedle של מיקרוסקופ לנתיחה. Microneedle משמש להעביר תאים נשלטת על ידי micromanipulator אשר זמינים עם דרגות שונות של אוטומציה.

Abstract

שמרים היא מערכת מודל ממושמע מאוד המשמש מחקר רבים בתהליכים תאיים שונים. המתח מעבדה משותפת

Protocol

בנייה של זנים דיפלואידי
פרוטוקול לייצור diploids ידי הזדווגות

1. זנים הראשוני צריך להיות הכה על YPD בינוני, או סלקטיבי במידת הצורך, כדי לייצר מושבות אחת. שני זנים הפלואידים צריך להיות סוג של הזדווגות ההפוך (כלומר, מאטה ו MATα).
2. באמצעות לולאה חיסון סטרילי לקחת חלק קטן במושבה מאחד שני זנים הפלואידים. על צלחת פס חדש YPD את הלולאה פעם אחת בקו ישר על פני הצלחת. סמן את כיוון פס עם חץ בתחתית הצלחת.
3. חזור על פעולה זו עבור זן השני בצלחת YPD אותו. הפעם פס בניצב אל המושבה הראשונה, חציית פס הראשון עם השני. סמן את כיוון פס השני וציין את האזור שבו פס second חוצה את הראשון. אזור זה יהיה שם diploids יופק.
4. דגירה את הצלחת YPD ב 30 ° C במשך הלילה.
5. Replica צלחת צלחת YPD על גבי מדיה סלקטיבית כי יהיה סלקטיבי היתר גידול שזה עתה קמו diploids.
6. פיק מושבה אחת אם אפשר, או חלק קטן של פס דיפלואידי ו פס על המדיום סלקטיבית אותו כדי ליצור מושבות אחת.

נביגה ועיכול asci
פרוטוקול

1. פיק מושבות אחת מהצלחת לעיל ולעשות קטן (1cm x 1cm) כתמים על נביגה (SPO) צלחות לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים sporulate.
2. נביגה ניתן לבדוק על ידי הסתכלות על התאים מפני תיקון כל במיקרוסקופ אור. תאים מקום בשקופית מיקרוסקופ μl 5-10 של מים, במקום coverslip על גבי אגל, ולחפש בנוכחות asci. אם asci לא נמצאים בקלות ואז להחזיר בחממה.
3. אם יש נביגה יעיל אחד התיקונים, להכין צינור סטרילי חרוטי עם 15 מ"ל של מיץ 100μL הטטרדה.
4. פיק תאים למעלה מ תיקון זה נביגה עם לולאה חיסון סטרילי 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומניחים מיץ הטטרדה. מערבולת בעדינות את הלולאה על מנת לאפשר לתאים ליפול הלולאה ומערבבים עם הפתרון.
5. השאירו במיץ הטטרדה (המכיל zymolyase) עבור 4-10mins (תלוי בריכוז ופעילות של zymolyase והמתח עצמה). זה מאפשר עיכול של התא הקיר המקיף את ascospores.
6. סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD.
7. אופציונלי. תגובת ניתן לעצור על ידי הוספת 1mL של קרים כקרח סטרילי DH ₂ O. אפשר התאים להסתפק 5mins. הסר 1mL מ supernatant ואז לערבב קלות ביד ולשמור על הקרח.
8. קח 5μL של תאים מתעכל משלב 5 ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD.
9. השתמש לולאה סטרילי חיסון 3mm להפיץ מאוד בעדינות את טיפות 1-3 פעמים בקו בעוד בקושי ביצירת קשר עם אגר.
10. אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר (אם צעד 7 מושמט, זה כאשר מערכת העיכול של התא הקיר החיצוני יהיה מופחת או להפסיק). המשך המיקרוסקופ לנתיחה.

Dissection של Asci
פרוטוקול

ראוי לציין, כי פרוטוקול הבאים מתוארת עבור מיקרוסקופ זינגר MSM מערכת המיקרומניפולציה 200. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה בשינויים קלים אם באמצעות micromanipulator ידני כגון micromanipulator MR Zeiss.

1. התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד.
2. עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום.
3. מעבר למצב החיפוש. איתור asci. רצוי לבחור asci אשר נמצאים באזורים בהם התאים מפוזרים היטב. הימנע שטחים עם אשכולות התא. ארבעת ascospores מ asci עדיין צריך להיות קשור אחד לשני. שני ascospores עשוי להיות מעט גדול יותר משני האחרים. הימנע לקטוף asci שבו ascospore רופף ולא מחובר לשאר ascospores.
4. תרימי נאד עם המחט. לאט לאט מביאים את המחט את הצלחת. כאשר צל של microneedle הוא ראה, בשורה הזאת עם נאד כדי להיות נטל. שוב הגישה את המחט עד קו המתאר השחור של מעגל (קצה המחט) נתפסת. מגע הטטרדה עם המעגל הזה ולאחר מכן במהירות למשוך את המחט משם. ודא כל ארבעת ascospores מתוך נאד דבקו המחט וכי אין תאים נוספים נאספו על microneedle כי אינם חלק נאד זה.
5. משוך את microneedle הרחק מן הצלחת וללכת המטריצה ​​(עבור נאד הראשונה, ללכתעמדת A1). שימו לב למיקום שבו כל נאד היא עברה. מניחים את נאד על ידי נגיעה צלחת עם microneedle ו מתרחק עד כל ארבעת ascospores ירדה microneedle. לחיצה עדינה של הזרוע מחט או את הפלטפורמה מחזיק את צלחת YPD הוא לעתים קרובות שימושי בשלב זה.
6. חזור על שלבים 3-5 ומקום asci לעבר עמדות ברציפות על המטריצה ​​עד המספר הרצוי של asci כבר הרים.
7. חזור אל נאד כל לשבור את ארבעה תאים לגזרים על ידי מתגרה עם המחט, הקשה על פלטפורמה בעדינות או שילוב של שניהם. תרים את התאים לעזוב אחד מאחורי במיקום חדש המטריצה ​​עד שכל ascospore ב נאד כל מופרד בשורות של ארבעה.
8. מניחים את צלחת YPD באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים כדי לבחון את דפוס הצמיחה.
9. Replica צלחת התאים גזור עד בינוני סלקטיבי במידת הצורך.

רילוקיישן של Zygotes
פרוטוקול

1. Streak את שני זנים הפלואידים עם סוגים הזיווג ההפוך על המדיום המתאים כדי להשיג מושבות אחת.
2. אלה Mate שני זנים כמתואר לעיל ולאפשר לגדול מ 4 עד 6 שעות (או לילה במקרה הצורך).
3. בדוק zygotes תחת מיקרוסקופ אור. Zygotes יופיעו המשקולת בצורת תאים עם או בלי ניצן.
4. פיק תאים עם לולאה חיסון 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומקום בעדינות 100μL של סטרילית DH ₂ O.
5. סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD.
6. קח 5μL ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD.
7. השתמש לולאה חיסון 3mm להפיץ את טיפות בקו בעדינות רבה תוך בקושי ביצירת קשר עם אגר.
8. אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר. המשך המיקרוסקופ לנתיחה.
9. התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד.
10. עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום.
11. מעבר למצב החיפוש. אתר זיגוטה.
12. תרימי זיגוטה עם המחט.
13. המקום zygotes בנפרד על המטריצה.
14. אפשר zygotes לגדול במשך כמה ימים.
15. צלחת Replica zygotes על המדיום סלקטיבית המתאימה.

נציג תוצאות

איור 1: זיווג של שני זנים הפלואידים סוגי ההזדווגות מול יוצרת זן דיפלואידי.

איור 2: (א) צלחת YPD עם תוצאות thre של הזיווג בין זן טמפרטורה רגיש (עם auxotrophy leu2 א) ו זן סוג בר (LEU2). תאים מתעכל פרושים באזור inoculum בצד שמאל איפה צמיחה עבה בין שני קווים שחורים נתפסת. Asci כי כבר גזור לגדול מחולקת באופן שווה במטריצה ​​בצד ימין. (ב) צלחת ב (א) היה משוכפל לצלחת הנשירה SD-לאוצין. הערה הצמיחה 02:02 עבור הסמן LEU2 המעידים על ascospore תוקף היה גזור. (ג) צלחת ב (א) היה משוכפל על צלחת YPD וטופחו על 37 ° C. שים לב כי הצמיחה 2:02 נוסף מאמת כי ascospore היה גזור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דיסקציה שמרים הוא כלי שימושי כדי לבחור זנים חדשים עם סמנים הרצוי. בעת קביעת דפוס הצמיחה התיאורטי של ארבעה ascospores חשוב להסתכל גנוטיפ של התא הווגטטיבי. אם הפלסמיד הוא ההווה, צריך לדעת אם הוא עותק יחיד, נמוך או גבוה כמו זה ישפיע אשר ascospore (ים) לקבל את הפלסמיד ואת ישפיע התחזי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222