השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

Summary

Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1. בדקנו את תפקוד sc1 בתמיכה ES העכבר תא עצמית חידוש בהעדר LIF והראה כי sc1 הוא מסוגל לשמור על התחדשות עצמית של ES תרבויות עכבר התא.

Abstract

עכבר גזע עובריים (ES) התאים בתרבית כמקובל עם פקטור מעכבות לוקמיה (LIF) כדי לשמור על התחדשות עצמית.

Protocol

1. הכנת צלחות MEF מזין

1. יום אחד לפני תאים ES culturing, אחד להפשיר בקבוקון של מוקרן E14.5 CF-1 תאים MEF מזין (ראה נוהל שלנו על איך להפשיר תאים ES).
2. פלייט מזין תאים MEF בצפיפות של 10,000 תאים / גם בצלחת 12 באר. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2. MEF תא התקשורת: DMEM בתוספת 10% ES-PBS, 1X גלוטמין ו 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו.

2. תחזוקה של התחדשות עצמית של תאים עכבר ES

1. ניתוק בתאי גזע עובריים באמצעות טריפסין. זרעים התאים בצפיפות של 50,000 תאים / מזין היטב על לוחות מוכן בעבר MEF בתקשורת צמיחה (ממ נוק KSR בתוספת 15%, 4 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 mM שאינם חיוניים חומצות אמינו 1X BME) בתוספת sc1 בריכוז הרצוי (השתמשנו 100 ננומטר, 300 ננומטר, ו 1 מיקרומטר). אנחנו גם הוסיף לשלוט חיובי היטב כי היה להשלים עם 1000 μ / ml של LIF. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
2. התרבות התאים ב 37 ° C ו 5% CO ₂ ימים 3-4 בקטע זה. רענן התקשורת כל 48 שעות.
3. מעבר תאים 1:10-1:15 עם טריפסין לשמור על צפיפות דומה לזו של צפיפות זריעה הראשונית. לאחר 5 קטעים, התאים ניתן לבדוק ביטוי של סמנים pluripotency טיפוסי באמצעות immunocytochemistry.

3. בחינת Immunocytochemical של סמנים pluripotency

1. לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
2. תקן את התאים עם 500 μl של מקבע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
4. בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 500 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. דגירה התאים עם 250 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי (השתמשנו Nanog, Sox2, SSEA1 ו Oct4 על דילולים הבאים: 1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 ו)
6. לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
7. דגירה התאים עם 250 μl של נוגדנים משני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו חמור נגד עכבר מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 555 ב ו - 1:2000 חמור ארנבת אנטי מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 488 ב 1 : 2000).
8. לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
9. הוסף DAPI (הריכוז הסופי 1 מיקרוגרם / מ"ל) לשטוף האחרון דגירה 5 דקות כדי להמחיש גרעינים.
10. נתח את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. נציג תוצאות:

1. מורפולוגיה התוצאות:

עכבר לתאי גזע עובריים (ESC R1) היו גדולים על תאים MEF מזין בנוכחות או LIF או sc1 לקיים עצמית והתחדשות בכל מדינה מובחן. אחרי הקטע השני, בידול יכול להיבחן בתאים ללא LIF או sc1 (שליטה שלילי) ואחרי 5 קטעים בעצם לא נצפו מושבות מובחן. LIF (בקרה חיובית) מושבות טופלו נותרו במצב מובחן לאורך 5 קטעים התא. תאים שטופלו sc1 בריכוזים של 300 ננומטר או 100 ננומטר גם נשאר מובחן לאחר 5 קטעים, לעומת זאת, בתאים שטופלו 1 sc1 מוות מיקרומטר תא מנוסה לאחר המעבר הרביעי. (איור 2 של פתק App) טבלה 1 מסכמת את התצפיות מורפולוגיים.

2. הביטוי של סמנים pluripotency

עכבר לתאי גזע עובריים לשמור על 5 קטעים היו קבועים נבדק על ידי immunocytochemistry עבור SSEA1, Oct4, Nanog ו Sox2. הביטוי מרקר היה דומה התאים נשמר LIF. (איור 3 ו -4 של פתק App)

איור 1: השוואה מורפולוגיה של תאים נשמר LIF או sc1. אין הבדל במורפולוגיה נצפתה.

איור 2 ו איור 3: Nanog, SSEA1, Sox2, ו Oct4 מכתים של תאים ES נשמר עם sc1 או LIF (איור 4 לציין האפליקציה). תאים נשמר sc1 להראות סמן דומה ביטוי pluripotency לתאי נשמר LIF.

טבלה 1

	בקרה שלילית	LIF חיובית שליטה	Sc1 1uM	Sc1 300 nM	Sc1 100 ננומטר
1 המעבר	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה
2 המעבר	מורפולוגיה חלק מובחן	דואר רגילS מורפולוגיה תא	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה
3 המעבר	רוב התאים הבדיל	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה
4 המעבר	אין ESC המושבות	ES רגיל תא מורפולוגיה	מוות של תאים שנצפו	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה
5 המעבר	הבדיל	ES רגיל תא מורפולוגיה	מוות של תאים שנצפו	ES רגיל תא מורפולוגיה	ES רגיל תא מורפולוגיה

Discussion

Sc1 מולקולה קטנה ניתן להשתמש כדי לשמור על התחדשות עצמית עם מדינה שלא עברו התמיינות בתאי עכבר ES. לפני השימוש בקו תא נבדק, לעומת זאת, זה צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי. לדוגמה, בדקנו בשלושה ריכוזים על ES העכבר התא קו ESC R1. 100 ננומטר 300 ריכוזים nM היו מסוגלים לקיים ES תאים העכבר, לעומת זאת, ריכוז 1 מיקרומטר היה רעיל.

Sc1 יכול לשמש גם תחת מזין ללא תנאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279