הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.

Abstract

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצמאי המזוהה עם פונקציות, מסוגל לבצע התנהגויות מורכבות בבידוד. הנוירונים שלה (10-25 מיקרומטר קוטר) מסודרים plexuses כי מוגבלים מטוסים שונים של דופן המעי

Protocol

חלק 1: הכנת רקמות

1. ההכנות submucous ו myenteric מקלעת מבודדים על ידי לנתיחה רציפים מן המעי הדק של 150-200 גרם (2-3 בשבוע הישן) הארטלי שרקנים כי כבר הרדים משאיפת ערופה isoflurane ו. לאחר המתת חסד, המעי הדק הוא נכרת ותוכנו להסיר על ידי שטיפה לומן עם פתרון, חם מחומצן. אנו משתמשים בינוני 199 בתוספת 25 HEPES מ"מ, 5 mM NaHCO ₃ ו 2 גלוטמין מ"מ, ו-pH המותאמת 7.4 (המכונה, מעתה ואילך, כמו M199-DM), אשר כבר מראש התחמם ב 37 ° C. כל השלבים הנותרים לפרוטוקול, לעומת זאת, תבוצע בטמפרטורת החדר.
2. קטע המעי, 8-10 ס"מ אורך, מועבר צלחת Sylgard המכיל M199-DM, נפתחה בגבול mesenteric, ועלה רירית בצד למעלה באמצעות סיכות חרקים. חשוב מאוד לשמור גם מתח, כך שלאחר מצמיד הרקמה תערוכות צורה מלבנית עם שורות villi הרירית מיושר באופן קבוע.
3. שימוש בסדר מלקחיים דומון עם טיפים ישר, במצב אופקי כמעט, קל לקלף רירית ידי לתפוס את villi בקצה אחד של הכנת ומתרחקת ממנו לאורך ציר האורך של הרקמה. כאשר המדגם הוא ניצח באופן שווה, סרטים של רירית ניתן להפרידו קווים בודדים, חשיפת submucosa המכיל את הגרעינים ואת submucous vasculature submucosal.
4. עבור לנתיחה את הקנס של plexuses, אנו ממליצים לנתח באמצעות מיקרוסקופ עם תאורה כהה שדה. ואכן, השפעת פסאודו תלת ממדי שנוצר על ידי סוג זה של תאורה עוזר להבחין בין שכבות בודדות, ובכך למנוע או למזער את הנזק שנגרם-מכשיר.
5. כדי לבצע הכנה submucosal, אנו בצע את ההליך הקלאסי של הירסט McKirdy ⁴ הדורש: א) ביצוע חתך בשכבה submucosal הבאים האוריינטציה של סיבי שריר עגול, זה יכולה להיות מושגת באמצעות מספריים דק מאוד (כגון מוריה MC19 או שווה ערך); ב) הרמת submucosa בעדינות עם מלקחיים בסדר, בעוד דוחפים את שכבת השריר העגול למטה באמצעות מספריים קנס; ג) חיתוך בשולי האורך כמו הפרדה התקדמות לשחרור submucosa משאר הכנה, ד) עושה חתך השני שלאחר האוריינטציה של סיבי שריר מעגלי במרחק הראשון, כדי להגדיר את הגודל הסופי של הכנת submucosal. קטע submucosal וכתוצאה מכך, וזה רק 30-50 מיקרומטר עבה ויש לו מראה דקיק, ניתן להעביר מנה נוספת Sylgard המכיל טרי M199-DM, הצמיד בעדינות ובלי מתח, והמשיך בחדר מחומצן לשימוש מאוחר יותר.
6. המקורי קטע מעיים, משולל עכשיו של רירית ו submucosa, ועם שרירים עגולה חשוף, עדיין ניתן להשתמש כדי להניב הכנה myenteric מקלעת. כדי לחשוף את מקלעת myenteric, צריך לחסל כמה שיותר שכבת השריר מעגלית. זו יכולה להיות מושגת באמצעות אותו קצה ישר מלקחיים בסדר המועסקים בשלבים הקודמים. צרורות של סיבים יכול להיות משך בעדינות, תחילה אחד ולאחר מכן מן הצד השני של התכשיר. Myenteric מקלעת חשוף לא ניתן להפריד את שכבת האורך של השריר ואת serosa הבסיסית. לכן, מה שנקרא הכנה myenteric מקלעת הוא קטע זה ניתן לחתוך לאורך הפינים. מכיוון שהוא מכיל חיים שריר, רצוי להצמיד אותו מאוד רופף בצלחת המכילה חמצן M199-DM עד הניסוי פיזיולוגיים מתחיל.
7. מאז רירית הוא החיישן העיקרי ENS, וכל effectors המוטבעים גם בקיר הבטן, אפשר לנתח למחצה שלם ההכנות לשמור מסלולים רפלקס כולו. אלה אישית מעוצבת ההכנות דורשים שילובים של השלבים המתוארים 1.3. עד 1.6., מיושם באזורים סמוכים של קטע המעי מבודדים.
8. דקות ספורות לפני הניסוי אופטי בפועל, הכנת בחירה מותקן בתא הניסוי, מוודא כי המתח מופץ באופן שווה הרקמה נמצאת שטוח לחלוטין נגד לתחתית Sylgard. זו מושגת על ידי מחזיק את הדגימה עם סיכות מצוין מספר כי ניתן למקם כל מסביב ללא גרימת נזק לרקמות.

חלק 2: הכנת דגימות רקמה הקלטה אופטית

1. (אופציונלי) כדי למנוע מן הקרינה רקע צבע מחייב שריר חלק שיורי ורקמות החיבור, plexuses הן מבודדות ניתן מודגרות דקות 30-60 ב M199-DM המכיל collagenase VII (≤ 50 U / ml) ו - פרוטאז IX (≤ 0.5 מיקרוגרם / ml). בעקבות הטיפול אנזים ההכנות יש לשטוף עם, ושמר במשך הלילה, M199-DM פלוס חיה בסרום של 10% (למשל, סוסים או בקר) ו אנטיביוטיקה (פניצילין, 100U/ml: סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם / מ"ל), תוך החדר רווי wiה 95% O ₂ ו - 5% CO _2. הליך זה, שבו השתמשנו במשך שנים רבות כי זה משפר במידה ניכרת את יחס אות לרעש של הקלטות אופטי, לא יכול להיות מועיל למתחילים יש לאמץ בזהירות. ואכן, הכנה שניזוקו במהלך דיסקציה מסתכן מתפורר במהלך הטיפול האנזים. עם זאת, גם בהיעדר טיפול האנזים, אנו ממליצים על ההכנות להישמר לילה עם בסרום באנטיביוטיקה M199-DM. צעד זה מקדם ריפוי רקמות לאחר דיסקציה חריפה נזק, ומגביר את השקיפות של המדגם.
2. הקלטות אופטי של פעילות חשמלית לא יכולה להיות מושגת כהכנה שבו הוא כיווץ השריר. לכן, כדי למנוע התכווצות שרירים בעת ההקלטה של ​​מקלעת myenteric, כמה דקות לפני הניסוי אופטי נוסיף 2 nifedipine מיקרומטר ל רחצה M199-DM הרקמה.

חלק 3: מכתים עם di-4-ANEPPDHQ

1. Di-4-ANEPPDHQ זמין מסחרית בצורה lyophilized. אנו ממליצים על פירוקה של אתנול טהור, מה שהופך פתרון מניות מרוכז [מ"ל למשל, 15-20 מ"ג /]. מלאי זה, כאשר כל הזמן ב -20 ° C, הוא יציב מאוד. ואכן, במעבדה שלנו, אנחנו רק סיים את הטיפה האחרונה של פתרון המניות של צבע זה שאנחנו עשה כמעט 6 שנים.
2. הפתרון מכתים אמור להיות מוכן ב M199-DM, ואת צריכה להכיל 2 מיקרומטר nifedipine אם הפרוטוקול מחייב. הריכוז הסופי של צבע יכול להיות נמוך כמו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - לא צריך להיות גבוה מ 50 מיקרוגרם / מ"ל. עם זאת, בהתאם לריכוז של מניות, סכום מסוים של אתנול יהיה נוכח הפתרון מכתים וצריך להילקח בחשבון. לדוגמה, פתרון מכתים עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של צבע יכיל ~ אתנול 0.3% אם עשוי מלאי מ"ג / מ"ל ​​15, אבל קרוב ל 1% אתנול אם המניה היה ריכוז של 5 מ"ג בלבד / ml.
3. עבור מכתים, הכנה הוא שקוע במשך 10-30 דקות בתמיסה צבע. לאחר תקופה זו, צבען הוא נשטף ובמקומו טריים, מחומצן M199-DM. מאז di-4-ANEPPDHQ הוא צבע קרום impermeant כי מאיר רק כאשר בסביבת שומנים בדם, נוירונים בריאה הכנה enteric מוכתם צריך את המראה של בלונים ריקים.

חלק 4: גירוי חשמלי

1. גירוי יכול להיות מונע על ידי מתח או זרם. אנו משתמשים גירוי הנוכחית, נמסר על ידי מחשב מבוקר, 4 ערוצים גנרטור גירוי עם תפוקה מקסימלית של 16 mA לכל ערוץ.
2. המודל אלקטרודה לשמש בניסוי נתון נקבע על ידי מטרת הניסוי. Pipettes תאיים או אלקטרודות התיקון ניתן להשתמש כאשר המטרה היא גירוי של נוירון מסוים. כאשר הגירוי נועד להפעיל יותר נוירון הגנגליון נתון, אלקטרודה תאיים לגעת חיבור ניתן להשתמש. כדי ללמוד הגרעינים מקשרות, גדול, נמוך התנגדות אלקטרודות ו / או רב אלמנט אלקטרודה arrays יכול להיות מועסק, אולם בעת השימוש בגירוי הנוכחי כפי שאנו עושים בדרך כלל, מרכיב רב מערכים להיות האופציה היחידה. מודלים רבים של אלקטרודות תאיים, כמו גם כמה מערכי אלקטרודות ליניארי, זמינים ממקורות מסחריים.
3. אלקטרודות ניתן למקם באמצעות סוגים שונים של micromanipulators. כדי למנוע את רעידות המושרה על ידי חביות ארוך בסדר, אנחנו בעד שימוש micromanipulators קטן על בסיסי מגנטי שיכול להיות ממוקם בסמוך לחדר הניסוי, ותמיכה חביות גמישה של אלקטרודות טונגסטן עם מוטות מתכת דקים אך נוקשה מאוד.

חלק 5: זלוף

אנו משתמשים במשאבת 2 ערוצים peristaltic עם ערוץ אחד עבור קלט של פתרונות מחומצן, והשני פלט. כדי למנוע הפרעה מכנית הנגרמת על ידי זלוף, המשאבה מופעלת-off במהלך הרכישה של נתונים אופטיים.

חלק 6: מנגנון הקלטה אתרים מרובים אופטי של פוטנציאל הממברנה

1. אופטי מרכיבים:
   
   מנגנון הקלטה אתרים מרובים אופטי של פוטנציאל הממברנה מורכבת NeuroCCD-SM המצלמה (RedShirtImaging) ו עדשה 1:10 demagnifier / ממסר רכוב על הצינור trinocular של מיקרוסקופ זקוף. מיקרוסקופ נע על המתרגם XY, ללא תלות בשלב זה קבועים ונוקשים לחלק העליון של הטבלה רטט פעיל בבידוד. כדי למזער את הרטט מוטס, המנגנון כולו מוקף וילונות אקוסטיים כבדים גג מיילר. Epi תאורה מסופק על ידי מנורת טונגסטן, הלוגן 100W מופעל על ידי היצע נמוך במיוחד אדווה משוב התייצב כוח. לאור האירוע הוא עשה מעין מונוכרומטי באמצעות מסנן חום, גבוהה ש הפרעה המסנן (HQ530/50) לבין 565 ננומטר (50% הילוכים) מראה dichroic. פליטת הקרינה מופרד באמצעות המראה dichroic ומסנן ארוך לעבור (HQ572LP). כוונותצפיפות של אור על האירוע מותאם באמצעות מסננים צפיפות ניטרלי. חוצה תאורה, לצפייה בהיר בתחום של הכנת מסופק על ידי מנורה נוספת 100 טונגסטן, הלוגן W מונע על ידי V 0-55, 1-10 אספקת החשמל כי לא נדרש כל בעל תכונות מיוחדות.
   
   
2. במהירות גבוהה מצלמה מפרט:
   
   העיצוב אלקטרוניים מאפייני הביצועים של המצלמה NeuroCCD-SM תוארו בפירוט ^3. בקצרה, מדובר ברזולוציה מקורר, נמוך, מהירות גבוהה של דיוק מצלמה המשתמשת אחורי דליל, גב מואר מרקוני CCD39-01 השבב (80x80 פיקסלים). דיגיטציה היא 14-bit, ואת מסגרת הדולר מלא 2 קילוהרץ. עם זאת, למטרות ספציפיות, ניתן להגדיל את מסגרת הדולר עד למקסימום של 10 קילוהרץ באמצעות שילובים שונים binning או להקטין את מספר הפיקסלים תפקודית. המצלמה יש יתרון חשוב של רעש קריאה נמוך ביותר (23 אלקטרונים kHz 2, 9 אלקטרונים kHz 1). בנוסף, פיקסלים שלה יש גם עומק גדול יחסית (215,000 אלקטרונים), המתיר לעוצמות אור מתון מסגרת חליפין גבוה.
   
   
3. רכישת נתונים ותוכנה ניתוח:
   
   הניסוי אופטי נשלטת על ידי Neuroplex, חבילת תוכנה מבית RedShirtImaging, שפועל כיישום בתוך פלטפורמת IDL (Interactive Data Language) וכולל תכונות רבות הדרושות להציג הרכישה, וניתוח של הנתונים האופטי.
   
   
4. נוסף המצלמה:
   
   כחלק בלתי נפרד של המנגנון, קרן splitter על הראש trinocular של ממסרים מיקרוסקופ תמונה של התכשיר על גבי המצלמה השנייה, CCD ברזולוציה גבוהה המחובר grabber מסגרת. התמונה, אשר רכשה ומאוחסנים באמצעות תוכנת גלובל תמונה / 2 מעבדה, יכול להיות על גבי התצוגה של תת אלפית שנייה זמן לפתור אותות אופטיים שנתפסו על ידי המצלמה NeuroCCD-SM כדי ליצור מפה מדויקת של המקור המרחבית של רשמה אופטית אותות מתח. במעבדה שלנו, חוטף מסגרת למצלמה הזו שוכן מחשב אחר מאשר אחד אחראי על רכישת נתונים תפקודית. לכן, את קובץ התמונה חייב להיות מועברים ממחשב אחד למשנהו, התאמות קטנות הגודל והמיקום של התמונה ברזולוציה גבוהה נדרשים לפני רישום מושלם של שתי מצלמות מושגת.

חלק 7: ניסויים אופטי

1. לפני הקלטה כל תפקודית, אנו רוכשים את התמונה ברזולוציה גבוהה בשחור לבן של האזור שממנו אנו מתכננים להקליט פעילות חשמלית באמצעים אופטיים (כפי שצוין 6.4). דימוי זה, כאשר על גבי המפה פיקסל של המצלמה במהירות גבוהה, מסייע לנו לזהות את המבנים הם המקור של אותות אופטיים.
2. בתצורת המערכת המתאימה, Neuroplex (ראה 6.3) שולט גם על הצמצם, וגם מעורר את גירוי חשמלי. מאז רכישת נתונים במהירות גבוהה דורשת כוח מחשוב רב, רצוי, אם בכלל אפשרי, להשתמש במחשב ייעודי עם כמות גדולה של זיכרון, כונן קשיח קיבולת גבוהה. זאת, לעומת זאת, הוא לא טריוויאלי. המערכת שלנו, למשל, כבר בת כמה שנים, מעסיקה נתונים לוחות הרכישה כי הם גדולים מדי כדי להתאים את המדינה-of-the-art מחשבים. כפשרה, אימצנו ומסור מערכת אופטית שלנו Precision של Dell 390 מצויד בכונן קשיח GB 500 ו 4 GB של זיכרון RAM. מחשב זה מאפשר לנו לשמור על שלנו יותר, אבל מספיק, A / D ו D / A לוחות, תוך מתן מספיק כוח להפעיל את הניסויים שלנו.
3. ברגע הרכישה נגמר, Neuroplex יכול להציג את התוצאות בפורמטים מרובים משלימה, שחלקם מפורטים להלן:
   1. אזור המסך שנקרא תצוגת דף מראה את התמונה גולמי של התכשיר כפי שנתפסו על ידי המצלמה במהירות גבוהה 80x80 כמסגרת בודדת. סופרפוזיציה על המפה פיקסל זה של התמונה ברזולוציה גבוהה הנרכשת עם המצלמה השנייה (כפי שהוסבר 6.4 ו - 7.1) משפר את היכולת של המפעיל לזהות תחומי עניין.
   2. כאשר פיקסלים של התצוגה בדף זה נבחרו תחת שליטה בעכבר, Neuroplex ממיר באופן אוטומטי יציאות אופטיות שלהם לתוך עקבות המראים את גודל השינוי האופטי רשום על ידי פיקסלים אלה כפונקציה של הזמן. (למשל, ΔF / F הזמן מול). המפעיל יכול להחליט האם עקבות אלה צריכים לשקף את הפלט של פיקסלים בודדים, או, ליתר דיוק, את הפלט חלל ממוצעים של לוקוסים מרובים מעל אזור נתון של התכשיר.
   3. הנתונים ניתן להציג גם בפורמט הסרט.
      
      על מנת להבטיח כי כל המידע הכלול פועל ניסיוני הפרט מופק באופן מלא, עם זאת, אנחנו בעד off-line ניתוח הנתונים האופטי. תוצאות נציג ניתוח זה זמינים.

חלק 8: כיצד להשיג את האיכות הטכנית בניסוי אופטי

ה 'ההצלחה דואר טכני של ניסוי אופטי נמדדת, בסופו של דבר, על ידי יחס אות לרעש של הקלטות. יתר על כן, יחס טוב אות לרעש אינה נובעת התגלות אבל ממסע. כמו ביצועים אופרה, התוצאה הסופית נקבעת על ידי ריבוי של גורמים שפועלים בסינרגיה. לכן, כדי להשיג ניסוי אופטי מבחינה טכנית, זה חיוני כדי לחדד, באופן עצמאי, מנגנון אופטי הכישורים הדרושים עבור כל שלב הפרט של הפרוטוקול. להלן רשימה של בעיות אזורים פוטנציאליים, מספר הצעות להימנע מבעיות לא צפוי תמיד ^5:

1. מקורות רעש
   
   יציבות מכונות אופטיות הם קריטיים בעת ההקלטה פעילות חשמלית עם מתח רגיש צבעים, כי השינוי השבר (ΔF / F), המשקף את התגובות הפיזיולוגיות קטן יחסית (<10% / 100 mV ברוב הקלטות בטן) ו עקבות רועש תמיד תוצאה מבשר רע. לכן, כדי לייעל את אות לרעש יחס, הכרחי כדי למנוע או לפחות למזער, את תרומתם של שני הגרועות ביותר: א) רעידות מכני, ב) תנודות מקור אור.
   
   
   1. תנודות מכונות נוצרות על ידי מגוון של מקורות מגוונים כמו תצורת ההתקנה, יציבות הבניין, הקרבה של ציוד ממונע, זרמי אוויר, רעש אקוסטי, תנועה נוזל, או חלקיקים מרחפים הפתרון ים. מערכת טובה הרטט בידוד, וילונות אקוסטיים למקרים קיצוניים (ראו, למשל, תיאור של 5.1), לעשות הבדל גדול הם שווים את העלות שלהם. בנוסף, הישר גישות, כגון סינון של פתרונות המשמשים בניסוי, או שימוש בסיסי מגנטי עבור, חלקים קטנים ניד של ההתקנה, הם יעילים למדי.
   2. מקורות אור הם יציבים ביותר בעצימות מעין מקסימלי. לפיכך, יש לקבוע גבול הנוכחי לאספקת כוח, בעת הצורך להפחית את עוצמת האור על ידי החדרת ניטרלי צפיפות מסננים בנתיב אור במקום על ידי הפחתת מתח. מנורות ארק הם רועשים מהותית. טונגסטן הלוגן, נורות או דיודות פולטות אור הרבה יותר יציבה צריך להיות הבחירה המועדפת ^6.
      
      
2. חיים גיל
   
   והניתוחים צריך להיעשות באמצעות במעיים של בעלי חיים צעירים, כי, כמו רקמת החיבור בתוך הבטן מקשיחה עם הגיל, הוא הופך להיות קשה יותר להפריד בין שכבות רקמה בודדים ללא גרימת נזק גדול על הנוירונים של שני plexuses, אשר מביא תהליכים ו efferent יכול לחצות גבולות השכבה ו / או פרויקט למרחק למדי לאורך ציר האורך של המעי. זו מייעצת, אשר ניתן להתעלם כאשר לומדים תוך ganglionic קשרים, היא בעלת חשיבות עליונה כאשר המטרה היא ניתוח ניסיוני של בין ganglionic מעגלים או הפעלת מסלולים רפלקס.
   
   
3. דיי הפנמה
   
   חשוב להשתמש בריכוז נמוך לצבוע ככל האפשר, כדי למזער את החשיפה אור מיותר. למרות di-4-ANEPPDHQ הוכיחה להיות הרבה phototoxic פחות צבעים אחרים, זה יהיה לקבל הפנימו, בסופו של דבר, כמו הבריאות של הכנת מידרדר. הפנמה דיי מפחית את יחס אות לרעש על ידי הגדלת באופן משמעותי את הקרינה רקע ^3.
   
   
4. אלקטרודה תחזוקה
   
   
   1. אלקטרודות יש לשטוף היטב היטב לאחר כל ניסוי. פיקדונות אורגני בקצות אלקטרודות טונגסטן להגדיל התנגדות אלקטרודה ומונעים גירוי.
   2. בידוד של אלקטרודה טונגסטן זמינים מסחרית הוא עדין מאוד ונוטים נזק. דליפה בידוד יהיה המחלף הנוכחי, לסכן את האפקטיביות של גירוי לבין לסכן את הצלחת הניסוי.
      
      
5. זלוף סכנות
   
   אין להשאיר את הגדרת ללא השגחה בעוד זלוף פועל. אם ב-זרימה החוצה זרימה של המשאבה peristaltic אינם מאוזנים כהלכה, שני אירועים אסון עלול להתרחש:
   1. שיטפון עלול לגרום נזק בלתי הפיך המיקרוסקופ.
   2. הכנה עלול להתייבש במהלך הניסוי.
      
      
6. תוכנה hassles
   
   זה חיוני כדי להכיר את עצמך עם התוכנה השולטת הרכישה, כמו גם ניתוח. Fast נתונים רכישת ו / או יצירה של קבצים גדולים מאוד נוטים בכונן המערכת על סף התמוטטות, ו Neuroplex, שהיא סלחנית למדי, יתרסק ללא הרף, אלא אם כן תנאי הגבול שלה יכובדו. הדקויות בתוך הרשומות, החמיצו בקלות כאשר ניתוח מוגבל לאזורים מוגבלים של עניין, לעתים קרובות מגלים את עצמם מציג סרט של הנתונים.

Discussion

פרוטוקול זה נכתב עם שני שערים בראש. הראשון הוא לשכנע חוקרים אחרים, בזכות ההתקדמות הטכנולוגית הרבה של העשור האחרון, הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית באמצעות מתח רגיש צובעת הפך אחד, מתודולוגיות החזק ביותר אמינה ובמחיר סביר ללימוד רשתות נוירונים שלמים, ואכן , זה יכול להי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	Sigma-Aldrich	M3769	With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate
Sylgard	Dow Corning	184 silicone elastomer kit
Insect pins used for dissection	F.S.T.	26001-30
Dumont forceps	F.S.T.	11203-23 or 11200-33
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors	F.S.T.	15371-92
Pins to hold the tissue during the experiment	Seirin Corp.	Seirin Spinex
Collagenase VII	Sigma-Aldrich	C0773
Protease IX	Sigma-Aldrich	P6141
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10439-016
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-Glutamine 100X	GIBCO, by Life Technologies	25030
Nifedipine	Sigma-Aldrich
Di-4-ANEPPDHQ	Molecular Probes, Life Technologies	D36802
4-Channel Stimulus Generator	Multi Channel System MCS GmbH	2000 Series
Peristaltic pump	Rainin	2-channel Dinamax RP-1
High-speed camera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
1:10 demagnifier / relay lens	Optem, Qioptiq Inc.
Upright microscope	Olympus Corporation	BX61TRF
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator	Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada	PSSG--BX2
Linear matrix electrodes	FHC, Inc.	Custom made
Active vibration-isolation table	Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA	Micro 60
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply	Kepco, Flushing, NY	ATE 75-15M
Heat filter	Schott AG	KG-1
High-Q interference filter	Chroma Inc.	HQ530/50
Dichroic mirror	Chroma Inc.	565 nm (50% transmission)
Long-pass filter	Chroma Inc.	HQ572LP
Acoustic curtains	Acoustical Surfaces, Inc.	BSC-25
Neuroplex	RedShirtImaging, LLC
IDL	ITT Visual Information Solutions
High-resolution CCD camera, with its own camera controller	Hamamatsu Corp.
Frame-grabber for high-resolution camera	Data Translation	DT3120K-1
Imaging software for high-resolution camera	Data Translation	Global Lab Image/2