הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

Summary

ויזואליזציה של In vivo RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ"א שכותרתו fluorescently לתוך Xenopus ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

לוקליזציה RNA הוא מנגנון שימור של הקמת הקוטביות בתא. Vg1 mRNA localizes לקוטב הצמחי של ביציות Xenopus laevis ופועלת במרחב להגביל ביטוי גנים של חלבון Vg1. פיקוח הדוק של הפצה Vg1 באופן זה נדרש מפרט שכבת נאות נבט בעובר המתפתח. אלמנטים RNA הרצף UTR 3 "של ה-mRNA, את אלמנט Vg1 לוקליזציה (VLE) נדרשים ומספיקים להעביר ישירות. כדי לחקור את ההכרה והובלה של mRNA Vg1 in vivo, פיתחנו טכניקה הדמיה המאפשרת ניתוח נרחב של טרנס גורם מנגנוני הובלה מכוונת דרך readout ויזואלית פשוטה.

כדי להמחיש לוקליזציה RNA, אנו לסנתז שכותרתו fluorescently RNA VLE ו microinject זו תעתיק לתוך ביציות בודדים. אחרי תרבות הביצית כדי לאפשר הובלה של RNA מוזרק, ביציות הן קבועות מיובש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ויזואליזציה של דפוסי לוקליזציה mRNA מספק readout לניטור מסלול שלם של רנ"א התחבורה לזיהוי תפקידים בהכוונת RNA תחבורה cis-משחק גורמים בתוך התמליל ואת טרנס משחק הגורמים לאגד את VLE (Lewis et al. 2008, Messitt et al. 2008). הרחבנו את הטכניקה הזו באמצעות לוקליזציה בשיתוף עם RNAs נוספים חלבונים (גניון ו Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), בשילוב עם הפרעה של חלבונים המנוע את cytoskeleton (Messitt et al. 2008) לחקור המנגנונים לוקליזציה mRNA.

Protocol

חלק 1: שעתוק של mRNA שכותרתו fluorescently.

1. Linearize DNA פלסמיד המכיל את הרכיב לוקליזציה RNA או רצף רלוונטיים אחרים ואת resuspend ב 1 מיקרוגרם / μl עם DEPC שטופלו H ₂ O. תבנית ה-DNA חייב להיות מקדם אתרים במעלה עבור שעתוק על ידי T7, SP6, או T3 RNA פולימראז.
2. מוסיפים את ריאגנטים הבא צינור 1.5mL סטרילי:

   א 10X Tx חוצץ (ראה M & M)	2 μl
   ב 20X כובע / NTP לערבב (ראה M & M)	1 μl
   ג 1 mM אלקסה פלואוריד 546-14-UTP (Invitrogen)	1 μl
   ד UTP, [α P-32] (1 μCi / μl) (פרקין אלמר)	1 μl
   ה DEPC-H 2 O	11 μl
   ו 0.2 מ DTT	1 μl
   ז RNasin (Promega)	1 μl
   ח תבנית ה-DNA ליניארי	1 μl
   i. RNA פולימראז (Promega)	1 μl

3. מערבבים בעדינות ריאגנטים צנטריפוגות קצרה (10 שניות. Microcentrifuge ב א).
4. דגירה של 2-4 שעות ב 37 ° C, המכסה את הצינור עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של fluorophore.
5. הוסף 1 μl 1 מ"ג / מ"ל ​​RNase ללא DNase (Promega) לבזות תבנית ה-DNA.
6. דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C.
7. הוסף 79 μl 20 mM EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה.
8. הסר μl 1 לצינור נפרד, שכותרתו "קלט" ולשמור.
9. ספין התגובה דרך טור 1 G50 מ"ל (ראה חומרים ושיטות), אשר יכלול נוקלאוטידים מאוגדים תוך למעט mRNA באורך מלא.
10. לרכז את הרנ"א על ​​ידי המשקעים אתנול:
    1. הוסף 250 μl 100% אתנול, 10 μl 7m CH ₃ COONH _4, 1 המוביל μl RNA (tRNA שמרים, 10 מיקרוגרם / μl) או 1 הגליקוגן μl (20 מ"ג / מ"ל).
    2. מערבבים היטב עד להקפיא מוצק ב -80 מעלות צלזיוס למשך> 30 דקות או על קרח יבש במשך 15 דקות.
    3. ספין במהירות המרבית microcentrifuge במשך 15 דקות, supernatant למזוג.
    4. שטפו עם 150 μl של אתנול 75%.
    5. ספין במשך 3 דקות במהירות המרבית supernatant microcentrifuge, למזוג.
    6. יבש את גלולה בשעה 37 ° C במשך 3 דקות, להבטיח כי כל אתנול התאדו.
11. Resuspend ב 11 μl DEPC-H ₂ O ולהסיר 1 μl אל צינור נפרד, שכותרתו "שילב".
12. קבע את ההתאגדות אחוזים לדלל את RNA ל 50 ננומטר (ראו חומרים ושיטות חישוב).
13. RNA צריך להיות קפוא 5 aliquots μl, לשימוש יחיד כדי למנוע הקפאה / הפשרה מחזורי והוא יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות ב -80 ° C.

חלק 2: הכנת Microinjection.

1. RNA אופן ההכנה:
   הפשירי aliquot של רנ"א (50 ננומטר), ו לפגל את הרנ"א על ​​70 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. ספין במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge במהירות המרבית כדי להסיר חלקיקים, ולשמור על הקרח.
2. הביצית אופן ההכנה:
   1. ניתוח להסרת השחלות מ Xenopus laevis הנקבות (נסקו).
   2. חתוך לחתיכות של השחלה laevis Xenopus לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של תמיסת collagenase (ראה חומרים ושיטות).
   3. לנער בעדינות על 18 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד ביציות מופרדות בבירור מן השחלה. בשל אצווה וריאציה אצווה, זמן collagenase הטיפול עשוי להשתנות ולהיות במעקב צמוד באמצעות בדיקה ויזואלית על מנת להבטיח defoliculation.
   4. אפשר ביציות להתיישב צינור, להסיר ולשטוף פתרון ביציות עם חיץ MBSH (ראה חומרים ושיטות).
   5. חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. זה פרוטוקול בידוד הביצית דומה לזה המפורט כהן ואח'. 2009.
   6. ידנית בשלב המיון III / IV ביציות (דומון, 1972) במאגר MBSH תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי. שלב III ביציות הן אטומות לחלוטין אך לבן, ואילו השלב הרביעי ביציות נעשים קצת יותר גדולים ומנוקדים פיגמנט. ביציות כי הם שקופים מעט צעירים מדי וביציות כי פיגמנט מלא או הפצה מקוטב התערוכה פיגמנט הם זקנים מדי.
3. מחט אופן ההכנה:
   Pull and שפוע מחטים לקוטר החיצוני של 0.05 מ"מ ~. (אנו משתמשים דראמונד מדעי 3.5 אינטש נימים (סדר # 3-000-203-G / X), ושות כלי סאטר micropipette חולץ וכן חברת WPI beveller).

חלק 3: Microinjection

1. כיול מחט עם DEPC-H ₂ O 2 nl לספק לכל זריקה. אנחנו מול עומס מחט שלנו באמצעות גז מונחה microinjector (ראה חומרים ושיטות), ו לכייל גודל טיפה באמצעות מיקרומטר.
2. טען RNA לתוך מחט.
3. המקום מיון ביציות לתוך צלחת זריקה המכילה מאגר MBSH. אנו microinject על צלחת עם שכבה של גומי מוקצף שחור. ביציות חיוור להתבלט גם על backgrou לבןnd.
4. בזהירות להזריק כל הביצית עם 2 nl של רנ"א על ​​50 ננומטר.
5. לגרש RNA, לשטוף עם מחט DEPC-H ₂ O, ו לטעון RNA הבא להזרקה.

חלק 4: תרבות הביצית

1. המקום ביציות בבאר צלחת 24 סטרילית היטב (Sigma Aldrich). אנחנו תרבות של עד אלף ביציות לכל טוב.
2. הסר חוצץ ולהחליף 400 μl O ocyte C ulture M edium (OCM; לראות חומרים ושיטות) לכל טוב. מניחים צלחת בתוך התרבות מיכל אוויר חזק פלסטיק עם מגבת נייר רטוב כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבות.
3. דגירה ביציות בגיל 18 ° C עבור נקודות זמן הנעים בין 8 ל 48 שעות.

חלק 5:, קיבוע התייבשות ואחסון של ביציות

1. מיין את כל ביציות מת במקום ביציות לשרוד צלוחיות זכוכית. אנחנו באופן שגרתי להתבונן> הישרדות 90%.
2. המקום ביציות ב MEMFA מקבע (ראה חומרים ושיטות) ורוק במשך 20 דקות. הגנו על ביציות מן האור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
3. לשטוף ביציות ידי הסרת מקבע והחלפת עם נפח שווה של חיץ MBSH. חזור על פעולה זו עוד פעם לשטוף עבור סכום כולל של שני שוטף.
4. לשטוף ביציות לתוך מתנול anhydrous:
   1. הסר חצי נפח, להחליף עם מתנול.
   2. חזור על שלב "a" פעמיים.
   3. הסר את כל הפתרון, להחליף עם מתנול.
   4. חזור על לשטוף מתנול.
5. ביציות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכנים התמונה.

חלק 6: הדמיה לוקליזציה RNA באמצעות מיקרוסקופיה confocal

1. לפני הדמיה, להוסיף סליקה של מוריי בינוני (02:01 בנזיל בנזואט, בנזיל אלכוהול) כדי FluoroDish כוס התחתונה (WPI Inc) כדי לכסות את פני השטח הדמיה.
2. בזהירות העברת ביציות של מתנול כדי FluoroDish, צמצום נפח של מתנול העבירה.
3. תמונה על מיקרוסקופ confocal הפוכה (השתמשנו בהצלחה LSM510 Zeiss ו TCS לייקה SP2).

איור 1:.. ויזואליזציה של לוקליזציה RNA subcellular ידי Microinjection מדביקים לו תווית של תמלילי fluorescently microinjection א בעקבות, RNA שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 546 מוגבל בתחילה לגרעין B. אחרי שמונה שעות של תרבות, RNA שכותרתו fluorescently השליטה ניתן לראות באופן אחיד מופץ הציטופלסמה של הביצית. C. עם זאת, RNA שכותרתו fluorescently המכיל רצפים כי לגייס את מכונות התחבורה ניתן לראות תהליך של לוקליזציה subcellular לקוטב הצמחי של הביצית (לכיוון למטה). בר סולם = 50 מיקרומטר.

Discussion

כאן יש לנו הציגה פרוטוקול המאפשר הדמיה לוקליזציה mRNA ב ביציות Xenopus. שיטה זו, באמצעות שכותרתו fluorescently תעתיקי רנ"א יש אות גבוה יחס רעש ממה שהושג בעבר עם digoxigenin שכותרתו תמלילי והוא פשוט יותר מהר מאשר ב-situ גישות מבוסס (Mowry ו מלטון, 1992, Gautreau et al. 1997). באמצעות שיטה זו, אנו י?...

Materials