כרוני סלמונלה עכבר אינפקטד דגם

Summary

לבסס מודל כרוני חיידקי עכבר נגוע מתמיד סלמונלה Typhimurium קולוניזציה במעי במשך 27 שבועות.

Abstract

המודל חיידקי עכבר נגוע היא מערכת מודל רב עוצמה ללימוד בתחומים כגון דלקת זיהום, אימונולוגיה, התמרה האות, ו tumorigenesis. חוקרים רבים ניצלו קוליטיס המושרה על ידי

Protocol

פרוטוקול זה כולל שלושה חלקים: זיהוי תרבית החיידקים gavage העכבר, סלמונלה.

1. הצמיחה סלמונלה מצב.

1. הכן את סלמונלה לוריא-Bertani מרק (LB) צלחת, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. בחר שיבוט מהצלחת LB והכניסו LB 7 מ"ל בצינור 12 מ"ל, וללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 5 שעות.
3. לחסן 50 מ"ל LB עם 0.05 מ"ל של תרבות שלב דגירה נייחים ב 37 ° C בלי לרעוד במשך כ 18 שעות.
4. ספין תרבית החיידקים למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם 6000 סל"ד במשך 10 דקות, להשעות את החיידקים באמצעות HBSS 100:3 יחס (LB: HBSS). לדוגמה:
   בכל תרבות LB 50 מ"ל יושעה ב 1.5 HBSS מ"ל.
5. עבור gavage החי, עוד למהול את תרבית החיידקים ביחס 1:10. לדוגמה:
   1.5 כל LB תרבות מ"ל יושעה ב 15 HBSS מ"ל.

2. סלמונלה, זיהום מודל *.

1. הכן את הפתרון סטרפטומיצין. עכבר כל תינתן 7.5 מ"ג של סטרפטומיצין ב 100 HBSS μl. לדוגמה, להכין סך 90 מ"ג של סטרפטומיצין ב 1.2 HBSS מ"ל במשך 10 עכברים. תמיד יש תוספת נפח כשמכינים את הפתרון סטרפטומיצין.
2. משיכה מים ומזון 4 שעות לפני הטיפול gavage הפה.
3. עכברים Gavage עם סטרפטומיצין עם 7.5 מ"ג של סטרפטומיצין (100 μl של HBSS עבור עכברים שליטה). תפוס את העור מעל הכתף עכבר בחוזקה עם האגודל והאצבע האמצעית, למתוח את הראש והצוואר עם האצבע על מנת להפוך את הוושט ישר. כוונו את הכדור קצה המחט האכלה לאורך הגג של הפה כלפי הצד הימני האחורי של הלוע, אז בעדינות לעבור לתוך הוושט להזריק את הפתרון 100 μl. ההתנגדות לא צריכה להיות מורגשת.
4. בגיל 20 שעות לאחר הטיפול סטרפטומיצין, מים ומזון נסוגה שוב לפני עכברים נגועים בחיידקים.
5. Gavage כל עכבר עם ההשעיה 100 μl ב HBSS או שטופלו HBSS סטרילי (שליטה) על ידי gavage הפה. ההליך gavage זהה 2.3) עכברים gavage עם סטרפטומיצין.

* ניסויים בבעלי חיים בוצעו על ידי שימוש ספציפי-הפתוגן ללא C57BL נקבה / 6 עכברים (Taconic, הדסון, ניו יורק) שהיו 6-7 שבועות כפי שתואר לעיל ^1. פרוטוקול שאושר על ידי האוניברסיטה של ​​אוניברסיטת רוצ'סטר ועדת משאבים בעלי חיים (UCAR).

3. איתור של סלמונלה במעי.

1. עכבר איסוף צואה (כ 100 מ"ג).
2. העברת דגימת צואה על צינור 1.5 צנטריפוגה מיקרו עם 1ml PBS ו מערבולת במרץ.
3. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 800 סל"ד. מעבירים את supernatant לתוך צינור microfuge נקי.
4. צנטריפוגה בסל"ד 6000 עבור 5min. Supernatant נמחקת ו 200 PBS μL הוא הוסיף את כדורי ואת vortexed.
5. Streak 200 PBS μl עם מפזר תא הפנויה על צלחת CHROMagar BBL לזהות סלמונלה. סלמונלה מינים מופיעים ארגמן (עלה סגול, ראה תמונה 1). אם התשואות 200 μl מושבות רבות מדי על הצלחת, או להשתמש 100 μl 50 μl עבור פס.

4. נציג תוצאות.

כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, קולוניזציה typhimurium סלמונלה ניתן להבחין במעי העכבר מעל 6 חודשים. סלמונלה יכול להיות מזוהים על ידי תרבות צואה מעל 6 חודשים (תמונה 1). בתור החוצה טיפוסי לבוא של מודל זה, הגוף שוקל אובדן ומוות להתרחש בתוך 4 שבועות זיהום הודעה. תלוי זני סלמונלה המשמש זיהום, עכברים מסוימים עשויים לא לשרוד מעל 6 חודשים.

באיור 1. סלמונלה מעיים של סלמונלה מינים מופיעים ארגמן (עלה סגול) בצבע, עקב הבדלים מטבוליים בנוכחות chromogens שנבחר. חיידקים אחרים הם או עכבות או לייצר מושבות כחול ירוק או צבע.

איור 2. הפרופורציות ההישרדות של עכברים נגועים עם מוטציה זן סלמונלה PhoP ^{ג, ג} PhoP אברה-ו PhoP ^ג AvrA-/AvrA +, PhoP ^ג אברה למשך 4 שבועות (28 ימים).

1. טבלת משקל גוף של עכברים נגועים עם סלמונלה למשך 4 שבועות.

	0	1 שבוע	2 שבועות	3 שבועות	4 בשבוע
שליטה	16.78 ± 1.05	16.91 ± 1.28	18.26 ± 1.23	19.31 ± 1.26	20.26 ± 1.15
PhoP ג	16.89 ± 1.03	17.14 ± 1.19	17.43 ± 1.63 *	18.68 ± 1.78	20.05 ± 1.11
PhoP c-אברה	16.91 ± 1.12	16.96 ± 1.39	17.06 ± 2.14 **	18.71 ± 2.18	20.15 ± 1.56
PhoP ג AvrA-/AvrA +	16.94 ± 0.96	17.17 ± 1.02	17.63 ± 1.42 *	18.44 ± 2.03	20.09 ± 1.17

* לעומת קבוצת הביקורת p <0.05
** לעומת קבוצת הביקורת p <0.01

טבלה 2. זני סלמונלה השתמשו במחקר זה.

שם	תאור	הפניה או מקור
סלמונלה 14028s	Wild מסוג S. typhimurium	ATCC
PhoP ג	Non-פתוגניים הרגולטור מורכב מוטציה	מילר et al. 1990
PhoP c-אברה	אברה-מוטציה	קולייר-היינס et al. 2002
PhoP ג AvrA-/AvrA +	PhoP ג אברה, אברה השלים עם קידוד פלסמיד	קולייר-היינס et al. 2002

Discussion

כדי להשתמש במערכת, זה הכרחי עבור החוקר ללמוד איך gavage החיות. אנו פרט מתודולוגיה להכין התרבות חיידקים gavage העכברים. כמו כן, אנו מראים כיצד לפקח על התמדה סלמונלה בדרכי (GI) במערכת העיכול. השלבים הקריטיים פרוטוקול זה כולל:

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610
Feeding needle	Popper & Sons, Inc.	7920
Streptomycin	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Disposable cell spreaders	Biologix Research Company	65-1010