הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Summary

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת מונוציטים In vivo במשך שעות, ימים או שבועות באמצעות מיקרוסקופ transcranial שני הפוטונים. אנו מדגימים כיצד להכין חלון דליל-הגולגולת המאפשר תצפית לסירוגין של microglia שקט כי יכול להיות מופעל על ידי הזרקת stereotactic צמוד של HIV-1 חלבון הרגולציה תאת.

Abstract

באופן מסורתי במדעי המוח, in vivo two הדמיה פוטון Murine של מערכת העצבים המרכזית יש מעורבים גם את השימוש ^1,2 הגולגולת פתוחים או דליל, גולגולת ³ ההכנות. בעוד טכניקה הגולגולת פתוח הוא מאוד תכליתי, זה אינו אופטימלי לחקר microglia כי הוא פולשני ועלול לגרום ההפעלה microglial. למרות הגישה דליל, הגולגולת היא פולשנית, חזר מחדש דליל של הגולגולת נדרש הדמיה כרונית מגבירה את הסיכון של פגיעה ברקמות ההפעלה microglial ומאפשרת מספר מוגבל של הפעלות הדמיה. כאן אנו מציגים שיטה כרונית גולגולת דקה חלון לניטור microglia Murine in vivo על פני תקופה ממושכת של זמן באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. אנו מדגימים כיצד להכין יציבה, נגיש, דילל-הגולגולת חלון קליפת המוח (TSCW) עם coverslip זכוכית apposed שנותר שקוף במהלך שלושה שבועות של התבוננות לסירוגין. זו הכנה TSCW הרבה יותר אינרטי immunologically ביחס ההפעלה microglial מאשר craniotomy לפתוח או גולגולת חזר דליל מאפשר מספר שרירותי של הפעלות הדמיה במהלך פרק זמן של שבועות. אנחנו מכינים TSCW ב ₃ CR CX-GFP ₁ / ⁴ + עכברים לדמיין microglia עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת כדי ≤ 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. כמו כן, אנו מראים כי זו הכנה ניתן להשתמש בשילוב עם זריקות המוח stereotactic של החלבון HIV-1 neurotoxic תאת, סמוך TSCW, אשר מסוגל גרימת microgliosis עמיד. לכן, שיטה זו שימושית מאוד לבחינת שינויים במורפולוגיה תנועתיות microglial ועם הזמן במוח החיים דגמים של הפרעת Associated נוירוקוגניטיבי HIV (יד) ומחלות ניווניות אחרות עם מרכיב neuroinflammatory.

Protocol

1. הכנת בעלי חיים עבור הדמיה

1. בניסויים שלנו, אנו משתמשים מבוגרים CR CX _{3 1} עכברים GFP / + המבטאים GFP ב שושלות תאים mononuclear, כולל microglia. ⁴ זנים שונים של עכברים יכול לשמש כדי לענות על הצרכים של פרוייקט ספציפי.
2. להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל של שלוש תרופות בהיקף של 0.05 מ"ג / ק"ג פנטניל, 5.0 מ"ג / ק"ג Midazolam, ו 0.5 מ"ג / ק"ג Medetomidine. ⁵ הכנה כירורגי TSCW מתחיל אחרי החיה כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון כמו קמצוץ הזנב. במהלך הניתוח והדמיה, אנחנו ממשיכים את החיה על כרית חימום כדי למנוע שלאחר ההרדמה היפותרמיה. במידת הצורך, במינון של המאיץ שליש מנה המקורי של קוקטייל ההרדמה יכולה להינתן כדי לשחזר את המטוס המקורי הרדמה.
3. כיסוי העיניים של החיה במשחה עיניים הגנה כדי לשמור על עיניים לחות במהלך ההרדמה, אשר מדכא את רפלקס מצמוץ של החיה. הסר את השיער מהקרקפת של החיה באמצעות סכין גילוח, מספריים, מספריים, או בשיטות כימיות. לחטא את הקרקפת בעזרת 10% povidone-יוד פתרון אתנול 70%. כל מכשירי ניתוח צריך להיות autoclaved, מעוקר עם מעקר חרוזי זכוכית, או לחטא עם אתנול 70%.
4. ביצוע חתך קו האמצע של הקרקפת בעזרת מספריים קטנים, החל מ 4-5 הזנב לגולגולת וקידום קדימה הקדמי של העיניים. חשוב כי חתך זה יהיה מספיק זמן, כי העור לא יפריע הדבקה הצלחת ראש המשמש לייצב את הראש במהלך עכבר שני הפוטונים הדמיה (איור 1). זהה את האזור להיות דליל תחת בהיקף לנתח. הימנע תחומי עניין ממוקם ישירות מעל התפרים הגולגולת, כמו הגולגולת היא יציבה פחות באזורים אלה שבבסיס כלי גדול קרומי המוח יפריע הדמיה.
5. החל אתנול 100% ואחריו פתרון 10% כלור וברזל במקלון צמר גפן סטרילי לייבש את קרום על גבי הגולגולת לגרד אותם באמצעות פינצטה קנס או סכין גילוח. אי להסיר את התוצאות ממברנות ב מצורף ראש יציב צלחת.
6. מניחים שכבה דקה של דבק 910 Permabond מסביב לקצוות של חלון הצפייה מתחת לצלחת את הראש. מניחים את צלחת ראש מצופה דבק על פני שטח של הריבית על הגולגולת של החיה עם לחץ קל (איור 1). חשוב כי את הצלחת ראש מודבק רק לעצם הגולגולת. כל העור או הקרומים כי הם לכודים בין צלחת את הראש ואת הגולגולת תקטין את יציבות הקשר. למרוח כמות קטנה של Acrylate סביב החלון צפייה באמצעות מזרק באופן מיידי את הדבק האג"ח. לבסוף, להחיל כמות קטנה של Loctite 454 את הקצוות של חלון הצפייה כדי למנוע הדלפות.
7. בורג את הצלחת ראש לבעל החי (איור 1) לבדוק את היציבות של צלחת ראש תחת בהיקף לנתיחה על ידי חיטוט קל עם זוג מלקחיים. לא צריך להיות שום תנועה של הגולגולת ביחס צלחת את הראש. מניחים טיפת מלח על חלון הצפייה על מנת להבטיח שאין נזילות.

2. הכנת חלון גולגולת דליל קליפתיים

1. לקראת דליל הגולגולת, לייבש את הגולגולת באמצעות שילוב של צמר גפן סטרילי אוויר דחוס. אנו דק בתחילה את הגולגולת עם קצת לקדוח סטרילי 007 IRF בתרגיל Microtorque השנייה להגדיר 4000 סל"ד. בעדינות רבה, להתחיל דליל בקוטר 2-2.5 מ"מ באזור מעגלי של הגולגולת. השתמש בתנועות גורף האור היחיד כמעט מקבילים הגולגולת; להשתמש שום לחץ כלפי מטה ישיר. עצור קידוח כל 20-30 שניות כדי להסיר אבק העצם באמצעות אוויר דחוס. אלו הפסקות לאפשר קידוח בגולגולת להתקרר כך שאין נזק חום הנגרמת על רקמת המוח הבסיסית.
   1. כמו קידוח מתקדמת, להבחין במעבר לשכבה moister העצם הספוגית (כלומר "diploe"). ברגע זה שכבת הוא הגיע, זהירות נוספת עם המקדחה.
2. מדי פעם לבדוק את הרזון של הגולגולת על ידי הצבת מלוחים מעל האזור דליל וצפייה מתחת למשטח הביתור. תמיסת מלח יהיה עוד יותר לאפשר פיזור חום. כמו הגולגולת הוא דליל, vasculature קטן הופך לגלוי.
3. השתמש microblade שיניים סטרילי כדי להשיג את סופי דליל תחת מלוחים, כמו microblade מספק משוב משושי הרבה יותר על היציבות של הגולגולת. זה מאפשר ההכנות הרבה יותר רזה עם המקדחה לבד. מניסיוננו, עובי הגולגולת האופטימלי הוא 10-30 מיקרומטר.
   1. חשוב לבדוק את הרזון של הגולגולת תחת מספר פעמים epifluorescence במהלך הניסיונות הראשונים בקבלת חלון גולגולת דקה. חדות ועומק microglia גלוי vasculature לתת אינדיקציה טובה לגבי מועד חלון מוכן הדמיה.
4. לאחר החלון מוכן, דבק פיסת מחוייט מלבני # 0 coverglass wi ה ממד של פחות מ 2 מ"מ בכל צד מעל החלון. שימוש בקוטר 1.0 מ"מ טפטפת זכוכית, מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate באזור הגולגולת דליל בזהירות למטה חתיכה קטנה של coverslip, ולאחר מכן לחצו בעדינות על הגולגולת לסחוט סכום עודף של דבק. חשוב כדי למנוע היווצרות בועה בין הזכוכית דבק מאז אוויר לכוד תגרום באזור שמתחת להיות אטום אופטית. דבק cyanoacrylate משמש משום שהיא נשארת שקופה כאשר יבש גם מונע עצם לצמיחה מחודשת קרום שמירה על הגולגולת מתחת לחלון דק ושקוף. אם יש דבק על גבי זכוכית המכסה, השתמש microblade כדי להסיר בזהירות את זה פעם אחת את הזכוכית המכסה נמצאת במקום ודבק יבש.
5. משכך כאבים (למשל, עצירות 2 מ"ג / ק"ג תת cutaneously) ניתנת מיד לאחר הניתוח מחדש מנוהל על סימנים של כאב, כולל רצון לזוז, לאכול או לשתות, איבוד משקל, ריור, piloerection, קולות הנשימה, וכו '

3. שני הפוטונים הדמיה

1. לקראת הדמיה two-פוטון, לכסות את TSCW עם מלוחים ולאתר את שטח של עניין תחת epifluorescence (איור 2). כדי לאפשר הדמיה עוקבות של האזור, לצלם באמצעות מצלמה הצילום.
2. עבור הדמיה two-פוטון, אנו משתמשים מחוייט שני הפוטונים מיקרוסקופ ⁶ עם טי: ספיר לייזר מכוון 920 ננומטר. Fluorescence מזוהה באמצעות צינור מכפיל במצב כל שדה זיהוי מסנן 580/180 פליטה. 20X מים טבילה העדשה (0.95 NA) משמש לאורך כל הפגישה הדמיה. התפוקה המקסימלית של כוח לייזר נגד מטרה מוגדרת בין 50 ל 65 mW.
3. בחר אזור של אינטרס שכבות בקליפת המוח I או II (עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial). כדי להקל מחדש הדמיה, לצלם תמונות של אותו שדה הראייה ב 1X, 2X, ו זום דיגיטלי 3X. כלי דם יכול לשמש ציוני דרך למצוא בקלות את אותו שדה הראייה במהלך הפגישות הדמיה הבאים. תחת זום של 3X, מספר Z-ערימות עם 80-90 Z-צעדים בערימה כל צעד 0.69 מיקרומטר ניתן לרכוש כל 5 דקות עד 30 דקות, אשר מאפשרת דגימה טובה של מורפולוגיה התנהגות microglial ולאורך זמן ( איור 3). בין הרכישות של Z-ערימות, יש לוודא את רמת מלח מעל TSCW, כמו גם עומק של החיה של הרדמה.

4. הזרקת רעלן עצבי HIV-1, תאת

1. ראשית, silanize הציפוי הפנימי של מחט מד 35 ו - 10 μL מזרק Microvolume למנוע בתצהיר תאת. משוך את הפתרון silanizing (Sigmacote) עד שהוא ממלא הן את מחט המזרק. אפשר פתרון לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. רוקן את הפתרון מן המזרק, להסיר את הבוכנה, ולאפשר את המזרק ואת המחט להתייבש לחלוטין. לבסוף, לשטוף את המזרק ואת המחט היטב במים deionized.
2. בצע קטן 0.5 מ"מ craniotomy בקוטר או 3 מ"מ מקורי או לרוחב TSCW שבה שני פוטונים התמונות הושגו בעזרת קצת תרגיל קטן ובזהירות דליל הגולגולת עד בזוג מלקחיים עם קצוות חדים ניתן להסיר את שכבת דליל של עצם משם בקלות. אנו משתמשים 10 μL מזרק Microvolume מצויד מחט מד 35 נשלט על ידי משאבה Ultramicropump מזרק III רכוב על micromanipulator 3-ציר ואחרי הזדנבות את קצה המחט craniotomy, הוא מתקדם בזהירות עד לעומק של 700-900 מיקרומטר להלן השטח שבו pial 3 μL תאת _1-72 (או אחרים הפרו דלקתיות) או מלח (או הרכב שליטה) מועבר על 80 NL / min.

5. בעלי חיים והשיכון

1. אם בעל החיים להיות צילמו מספר פעמים ביום אחד, לכסות את השטח הפתוח של הגולגולת בתערובת של משחה עיניים ו וזלין כדי למנוע סבל או נזק הגולגולת בין המפגשים הדמיה. נתק את גשר תמיכה של הצלחת ראש קטן (ראה איור 1B) והמקום חיה בכלוב מחומם עם אוכל נגיש ומים. כל החיות הם ישוכנו ביחידים לאחר הניתוח בכל עת. לאחר פגישות עבור הדמיה חיה מלאים עבור יום נתון, להסיר בזהירות את כל הראש הצלחת לתפור את העור בחזרה מעל הגולגולת עם # 6 או תפר קטן. שוב, בית החיות ביחידות עם מזון ומים נגיש בקלות בין ימי הניסוי. בדוק את החיות יומי עבור כל סימני מתח, כאב או דלקת.

6. נציג תוצאות

באיור 1. ייצוב של חיה עבור ניתוח שני הפוטונים הדמיה (א) ו צלחת ראש העיצוב (B).

איור 2. GFP שכותרתו דמיינו microglia עם epifluorescence.

jove_content ">
איור 3. GFP-שכותרתו microglia דמיינו עם הדמיה שני הפוטונים לאחר ההשתלה של TSCW, כ 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. הסינגל שני הפוטונים קטעים שצולמו 15-30 דקות לאחר ההשתלה של TSCW (יום 0), כמו גם 7 ו 17 ימים מאוחר יותר, להוכיח כי חלונות תישאר ברורה תוך microglia להישאר מובטל בהיעדרו של עלבונות דלקתיות. Z-תחזיות לקחת 6 ו - 24 שעות לאחר הזרקת רעלן עצבי מידה HIV שינויים מורפולוגיים תערוכה מרשימה של הפעלת שריר כלשהו. בר קנה מידה: 10 מיקרומטר.

Discussion

יש קונצנזוס הולך וגדל כי המצע האמיתי של HIV-1 הגירעונות הקשורים נוירוקוגניטיבי (יד) הוא הרס של האדריכלות הסינפטי, שנגרם ככל הנראה על ידי תומכי מתווכים דלקתיים שוחרר מבית HIV-1 phagocytes mononuclear נגועים. הפעלת Microglial, תאים ענק multinucleated ו דבקת בשל היפרטרופיה astrocytic נחשבים סימני ההיכר ספציפי של הידבקות ב-HIV-1 ו דלקת של מערכת העצבים המרכזית ^7. לעומת זאת, חומרת המחלה הנוירולוגית premortem כבר בקורלציה עם הפסד של מורכבות הסינפטי, כמו גם נטל macrophage ב CNS ^8,9,10,11. עם זאת, אינטראקציות בין דינמי microglia, מקרופאגים חדירה הפריפריה, ואת הנוירונים בחולים עם היד פשוט לא יכול להיות המודל באמצעות עיבוד סטטי קונבנציונאלי המתקבלים ללימודים immunocytochemical קונבנציונאלי. מחקרים שנעשו לאחרונה ממעבדות שלנו הראו כי לפחות חלק מהם יחסי הגומלין בין התאים mononuclear ונוירונים הפריפריה מרכזי יכול להיות המודל בחלקו על ידי הזרקת stereotactic של חלבון ה-HIV-1 תאת _1-72 לתוך המוח parenchyma (Lu, דה מרקר, Tremblay, צ'י, ו גלברד, נתונים שלא פורסמו). לכן החלטנו ליישם בתחום ההדמיה vivo פוטון שניים לבחון את יחסי הגומלין בין הנגזרות מונוציטים מקרופאגים, תושב microglia הנוירונים במוח, במודל חיה צייתן קטן עבור neuroAIDS. בעוד ההכנות הגולגולת פתוחים או דליל, גולגולת להרשות לעצמם בדיקה בודדת של ארכיטקטורה קליפת המוח לתקופה קצרה של זמן (שעות), החוקרים מעוניינים במהלך זמן של אירועים subacute לא יכול להשתמש אלה ההכנות ללא artifactually הפעלת microglia / macrophage עקב מניפולציה כירורגית של החלון calvarial. כאן אנו מדגימים דרך פשוטה לעקוף את המגבלה הדביק פיסה זעירה של coverslip זכוכית מעל האזור הגולגולת דליל מניעת calvarium מתוך התחדשות TSCW כמו גם שמירה על שקיפות עבור ≥ 3 שבועות. בנוסף, אנו מראים כי טכניקה זו מאפשרת לנו לפקח על התנהגותם של מונוציטים היקפי להיכנס microvasculature מוחין וכן המוח תושב microglia בתגובה הזרקת stereotactic של HIV תאת _1-72 בקליפת המוח של עכברים הטרוזיגוטיים CR CX _{3 1} / GFP ( כדי לזהות תאים של שושלת mononuclear). טכניקה זו יכולה בקלות להיות מותאם לשימוש על עכברים עם רקע גנטי שונה, למשל, אנו משתמשים באופן שגרתי הטרוזיגוטיים CR CX _{3 1} / X-GFP Thy-1 YFP ¹² עכברים לחקור את יחסי הגומלין בין הנגזרות מונוציטים מקרופאגים, תושב microglia המוח נוירונים במודלים vivo של neuroinflammation רלוונטי ביד. הכנה TSCW שלנו מאפשר לחוקרים ללמוד תאים תאים אינטראקציות בין הפריפריה CNS שעלולות להתרחש על פני תקופות של שבועות, שבו חיה ניתן הדמיה פעמים לפני ואחרי הטיפול הניסיוני. לפיכך, כל בעל חיים יכול לשמש מלאה משלה. אזהרה אחת עבור דגם זה TSCW הוא התאים היעד תחת חקירה צריך להיות מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבוני ניאון משופרת (eXFP) או להיות מתויג עם פלורסנט לצבוע ללא הפרה מכניות של calvarium, וכי הביטוי eXFP חייבים להיות חזקים מספיק כדי לאפשר ארכיטקטורה הסלולר להיות דמיינו לאחר פגישות הדמיה חוזרות ונשנות על פני תקופה של שבועות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate	Hospira Inc.
Midazolam hydrochloride	Baxter Internationl Inc.
Medetomidine hydrocholoride (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Heating pads	Beyond Bodi Heat
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Povidone-iodine 10% solution	Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution	Ricca Chemical Company	3120-32
Methyl cyanoacrylate 910	Permabond
Cyanoacrylate 454	Loctite
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Microtorque II handpiece kit	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 drill bits	Fine Science Tools	19008-07
Norland bendable microblade full radius	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylate	The Original Superglue
#0 glass coverslip	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μl Microvolume syringe	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
35 gauge NanoFil needle	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Ball Mill, Carbide bits #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai	Newport Corp.