סיכום של Curve ערוץ IV יון באמצעות רכיבי תדר

Summary

ישנם מכשולים טכניים למדידת שטף זרם דרך תעלות יונים בו זמנית, ועל הבחנה מאוחר יותר מה החלק הנוכחי הטרנסממברני בשל כל סוג ערוץ. כדי לענות על צורך זה, שיטה זו מציגה את הדרך ליצור את עקומת IV של סוגי ערוצים בודדים באמצעות רכיבי תדר ספציפי.

Abstract

מבוא: נכון להיום, אין שיטות הוקמה כדי למדוד את מספר הערוץ סוגי יונים בו זמנית לפרק הנוכחי נמדד לחלקים לייחס כל סוג ערוץ. מחקר זה מדגים כיצד ספקטרוסקופיה עכבה יכול לשמש כדי לזהות תדרים ספציפיים מאוד לתאם עם משרעת המצב היציב הנוכחי למדוד במהלך הניסויים מהדק מתח. השיטה כוללת החדרת פונקציה רעש המכיל תדרים ספציפי לתוך פרוטוקול הצעד מתח. בעבודה המוצגת, תא המודל משמש על מנת להוכיח כי אין מתאם גבוה מוצגים על ידי המעגלים מהדק מתח, וגם כי תפקידו הרעש עצמו לא להציג את כל המתאמים גבוהים כאשר אין תעלות יונים קיימות. אימות זה הכרחי לפני הטכניקה ניתן ליישם תכשירים המכילים תעלות יונים. מטרת הפרוטוקול המוצג הינו כדי להדגים כיצד לאפיין את תגובת תדר של סוג יון ערוץ יחיד לתפקד רעש. לאחר תדרים ספציפיים זוהו סוג ערוץ בודדים, הם יכולים לשמש כדי לשחזר את המצב היציב הנוכחי מתח (IV) עקומה. תדרים מאוד לתאם עם סוג אחד של ערוץ מינימלית לתאם עם סוגי ערוצים אחרים עשויים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את התרומה הנוכחית של ערוץ סוגים רבים נמדד בו זמנית.

שיטות: מדידות מהדק מתח בוצעו על תא באמצעות מודל מתח סטנדרטי צעד פרוטוקול (-150 עד 50 mV, 5mV צעדים). פונקציות Noise המכיל הבהירויות שווה של 1-15 קילוהרץ תדרים (אפס לשיא אמפליטודות: 50 או 100mV) הוכנסו לתוך כל שלב מתח. הרכיב האמיתי של Fast Fourier Transform (FFT) של אות פלט חושבה עם ובלי רעש עבור פוטנציאל כל צעד. העוצמה של כל תדר כפונקציה של מתח היה צעד בקורלציה עם משרעת הנוכחי על מתח המקביל.

תוצאות ומסקנות: בהעדר רעש (שליטה), בסדרי גודל של כל התדרים למעט רכיב DC בקורלציה גרוע (| ר | <0.5) עם עקומת IV, ואילו מרכיב DC היה מקדם המתאם עולה 0.999 במדידות כל. איכות הקשר בין תדרים בודדים עקומת IV לא השתנה כאשר פונקציה רעש נוספה פרוטוקול הצעד מתח. כמו כן, הגדלת המשרעת של הפונקציה רעש גם לא להגדיל את המתאם. מדידות בקרה להוכיח כי מהדק מתח המעגלים כשלעצמו אינו גורם תדרים מעל הרץ 0 עד מאוד לתאם עם עקומת IV היציב. כמו כן, המדידות בנוכחות פונקציה הרעש להוכיח כי הפונקציה רעש אינו גורם תדרים מעל 0 הרץ לתאם עם עקומת IV היציב כאשר אין תעלות יונים קיימות. בהתבסס על אישור זה, השיטה כעת ניתן ליישם תכשירים המכילים סוג יחיד ערוץ יון עם הכוונה של תדרים זיהוי אשר אמפליטודות לתאם במיוחד עם סוג ערוץ.

Protocol

1. הכינו פונקציה רעש אות קלט

1. יצירת פונקציה רעש המכיל רכיבי התדר הרצוי. ניתן לעשות זאת על ידי תיאור רכיבי התדר הרצוי התדר ואז לחשב ההופכי Fast Fourier Transform. במחקר זה, 1-15 kHz היה בשימוש. הופך כל פורייה ו פורייה ההפוכה הופכת המתוארים במחקר זה חושבו באמצעות Matlab FFT של ופונקציות IFFT.
2. סולם את המשרעת של הפונקציה רעש בהתאם. במחקר זה פונקציה הרעש היה בקנה מידה כזה אפס לשיא המשרעת של הפונקציה הרעש היה 50 או 100 mV.
3. יצירת קובץ גירוי בשיטות המתאימות תוכנה רכישת בשימוש. עבור Clampex 8, תחילה ליצור קובץ טקסט עם הכותרת המתאימה. מתחת לכותרת, להכניס את בתוספות הזמן לטאטא בודד בעמודה הראשונה. במרווחים של זמן צריך את המרווח הזמני זהה מרווח הדגימה בשימוש המדידות. עבור לטאטא כל בפרוטוקול צעד מתח להכניס את המתחים המדויק הרצוי בכל צעד זמן. זו צריכה לכלול את הפונקציה רעש.

2. לבצע מדידות מתח קלאמפ

1. יצירת פרוטוקול המדידה בתוך התוכנה הרכישה תואמת קובץ הגירוי שנוצר בעבר. ב Clampex, קיים תפריט המאפשר למשתמש לשייך קובץ גירוי עם הפרוטוקול הנוכחי.
2. צרף מודל (או ביולוגי) תא לציוד המדידה.
3. בצעו את הניסוי כמתוכנן. לצורך בקרה, הקפד לכלול מדידות תקופתיות שאינן כוללות כל הפונקציות רעש.

3. ניסוי פוסט ניתוח

1. חשב את עקומת IV הקלטה בודדת. אם ההקלטה היא במצב יציב כאשר פונקציית רעש מוחל, עקומת IV ניתן ליצור באמצעות חלק המצב היציב של ההקלטה temporally מחוץ לטווח של הפונקציה רעש. אם ההקלטה לא היה מצב יציב, הפונקציה רעש עלול להפריע החישוב של עקומת IV, אז הקלטה השנייה צריכה להתבצע ללא הפונקציה רעש הנוכחי.
2. לכל שלב מתח הקלטה לחשב את פורייה מהירה להפוך החלק של הקלטה שבה הפונקציה רעש הוכנס. מערבבים את התמרת פורייה עבור כל שלב מתח amxn לתוך המטריצה, כאשר m הוא מספר תדרים FFT, ו n הוא מספר הצעדים מתח. בתצורה זו, כל שורה של המטריצה ​​מייצג את המשרעת של תדר אחד בכל הצעדים מתח בניסוי.
3. עבור כל תדר (כלומר, כל שורה במטריצה ​​לעיל) לתאם את השורה עם עקומת IV שנוצר 3.1 ולהקליט את מקדם המתאם.
4. מגרש מקדם המתאם תדירות לעומת לדמיין תדרים אשר מאוד לתאם עם עקומת IV. מאז רכיב DC הכלול בתוך תדר הראשון של FFT, מקדם המתאם עבור תדר זה תמיד צריך להיות> 0.99.

4. נציג תוצאות:

מדידות מתח נציג מהדק מוצגים לתא מודל ללא (איור 1A) עם פונקציה (איור 1B) רעש מוכנס לתוך פרוטוקול הצעד מתח. עקומת IV חושבה גם תא המודל (תרשים 1C). במשך כל לטאטא, את הקלטות של איור 1, FFT היה מחושב על מסגרת הזמן שבה הפונקציה רעש הוכנס (ראו מסגרת אדומה דמויות 1A, 1B). איורים 2 א ו -2 להראות FFTs מחושב עבור ההקלטות שמוצג באיור 1A ו-1B, בהתאמה. לאחר בדיקה חזותית, מרכיב DC (מסומן באדום) מופיעה לחקות את הצורה של עקומת IV. ללא הפונקציה רעש, כל התדרים מעל הבירה נראה כי אמפליטודות קרוב לאפס (איור 2 א). כאשר הפונקציה רעש מוכנס, תדרים בין 1 ל 15 קילוהרץ יש אמפליטודות בולט חזותית (תרשים 2B). איור 3 מראה את התוצאה של correlating אמפליטודות תדר בודדים על פני טווח של מתח צעדים נגד עקומת IV. איור 3A-C מציג את מקדמי המתאם כאשר הניסוי נעשה בתנאים מבוקרים (ללא פונקציה רעש) ועם אמפליטודות רעש של 50 ו - 100 mV, בהתאמה. שימו לב בכל המקרים, מרכיב DC נראה מתאם כמעט מושלם עם עקומת IV. ואכן, עבור כל הקלטות, מקדם המתאם עבור תדר זה היה יותר מ 0.99 (R = 0.9996 ± 1E-5, סטיית תקן ממוצע ±). כאשר אנו מסתכלים על איור 3A (תנאים שליטה), אין תדרים מלבד רכיב DC אשר משרעת משמעותית בקורלציה עם עקומת IV. באופן ספציפי, אף אחד התדרים האלה יש מקדמי מתאם גבוה מ -0.5. עם הכניסה של הפונקציה הנמוכה ביותר משרעת רעש (50 mV), תדרים אלו עדיין היו באותו מקדמי המתאם פחות מ -0.5. מקדמי המתאם עבורתדרים se גם לא להיות יותר מ 0.5 כאשר משרעת רעש הוגדל ל 100 mV.

. איור 1 דגם נייד הקלטות: הקלטות מהדק מתח מוצגים לתא מודל ללא (1A) עם פונקציה (1B) רעש נכלל בפרוטוקול צעד מתח. עבור הראשונה והאחרונה של 20 מילישניות לטאטא כל הפוטנציאל הוחזק על הפוטנציאל מחזיק (0 mV). כל צעד היה מתח 80 ms זמן, והפונקציה רעש הוכנס 40 מילישניות לאחר תחילת השלב. הפונקציה הרעש היה משך הזמן של 30 אלפיות והכילה תדרים בין 1 ל 15 קילוהרץ. מתח היה צעד הלוך ושוב, עד 50 mV -150 בקפיצות של 5 mV. עקומת IV עבור התא הדגם מוצג גם (1C). כדי להפוך את ההקלטות קל יותר לקריאה, רק לטאטא מדי החמישי היה כלול 1A ו-1B, אבל כל מטאטא נכללו 1C.

איור 2 FFT של הקלטות:. FFT חושבה עבור חלק ms 30 של לטאטא כל אחד שם את הפונקציה רעש הוא להיות מוכנס (האזור מוקף בתיבת אדום דמויות 1A, 1B). איורים 2 א ו -2 להראות FFTs המחושב ללא ועם הפונקציה רעש, בהתאמה. שוב, למען הבהירות, רק FFT מן לטאטא כל החמישי הוא נכלל הדמות, אבל כל מטאטא שימשו בחישובים בעתיד.

. איור 3 תדרים מתאמים IV: התוצאות של המתאמים בין עקומת IV של הקלטת ואת משרעת של תדרים בודדים על פני טווח של צעדים מתח מוצג. איורים 1 א - 1C להראות את מקדם המתאם עבור התדרים מ 0 עד 20 קילוהרץ בתנאים שליטה, בנוכחות של 50 או 100 פונקציות רעש mV, בהתאמה.

איור 4 מחדש יצירה של עקומת IV:. עקומת IV עבור התא המודל (כמו תרשים 1C) ואת גודל של שני תדרים היו מעולף. תדירות הראשון היה רכיב DC (R = 0.995), והשני היה תדר שנבחרו באקראי עם קורלציה נמוכה (R = 0.3212). אמפליטודות תדירות היו מדורגים על משרעת בערך כמו עקומת IV.

Discussion

ישנם מכשולים טכניים כיום למנוע חוקרים מדידה מרובים ערוץ סוגי יונים בו זמנית מתוך כוונה מאוחר יותר לקבוע כמה זרם לייחס לכל סוג ערוץ. בגלל מגבלה זו, תעלות יונים נלמדים בדרך כלל בנפרד באמצעות טכניקות כגון מהדק פוטנציאל מתח, זרם, פעולה. ¹ כדי לחקור סוגים ערוץ יחיד, Heterologous מערכות ביטוי משמשים לעתים קרובות. ² כאשר עובדים עם תאים מבודדים רקמות, כגון cardiomyocytes , באמצעים אחרים יש להשתמש כדי לחסום תעלות יונים שונים. לדוגמה, תעלות הנתרן יכול להיות מומת על ידי כבש מתח איטי depolarizing, ³ תעלות אשלגן פנימה לתיקון ניתן לחסום עם BaCl2 תאית, ⁴ ערוצי סידן ניתן לחסום באמצעות verapamil ^5.

שיטה אחת בשימוש כי חלקית מתגבר על מגבלה זו היא למדוד זרם זרם דרך שני סוגי ערוצים בו זמנית, ולאחר מכן לחזור על המדידה לאחר סלקטיבי חסימת סוג אחד הערוץ עם סוכן המתאים. חיסור של שתי מדידות לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את כמות המיוחס הנוכחית לסוג ערוץ שנחסם. ⁶ עם זאת, ישנם שני המגבלות העיקריות על הטכניקה הזו. ראשית, חומרים כימיים לא זוהו באופן סלקטיבי יכול לחסום כל ערוץ יון, ועוד כמה תרופות בשימוש נרחב יש שאינם ספציפיים אינטראקציות עם סוגי ערוצים אחרים. ^5,7 שנית, לא ניתן לקבוע מתוך הטכניקה הזו אם ערוץ אחד היא מווסתת על ידי אחר ערוץ. לדוגמה, הביטוי הטרוגנית של NAV 1.5 ו - 2.1 קיר, הוכח החדרים קביה, והוא הוצע כי קיימת מערכת יחסים סינרגטיים בין שני הערוצים, כך גבוה יותר 2.1 קיר, ביטוי החדר הימני מדכא מהירות ההולכה. ⁸ כיום , זה לא ניתן לאמת.

במחקר זה, אנו מציעים ספקטרוסקופיה עכבה עשוי להיות כלי שימושי לחקר מרובים ערוץ יון סוגי נמדד בו זמנית. למרות שמעולם לא הציג שיטה נעשה שימוש כדי להבחין בין שני סוגי זרמים ערוץ נמדד בו זמנית, ספקטרוסקופיה עכבה שימש ללמוד מספר היבטים אחרים של תפקוד ערוץ יון. גודמן אמנות הראה באמצעות השמיעה צב שיער תאים פרוטוקולים מהדק הנוכחי יכול להיות שונה לכוון תא אל תדרים שונים, ואת תנודות בפוטנציאל הטרנסממברני בשל יחסי הגומלין בין פנימי לתיקון K ⁺ ערוץ ערוץ Ca ^{2 +. 9} האן פרייזר עכבה הוכיח כי ניתן למדוד בתא בודד על פני טווח רחב של תדרים (100 הרץ עד 5 MHz), והגידול עכבה נצפתה כאשר K ⁺ או Ca ^{2 +} ערוצי נחסמו יכול להיות אמצעי פשוט לאתר לחסום ערוץ מסכי התרופה גבוהה התפוקה. ¹⁰ היאשי פישמן השתמשו מוליכות מורכבים ללמוד מאפייני הקינטית של תיקון פנימי K ⁺ ערוץ ^11. קבוצות אחרות יש תדר בודד מוכנס לתוך פרוטוקול מהדק מתח של סוגי ערוצים שונים הראו כי תגובת תדר נצפתה הסכים עם התגובה הצפויה של כמה תדרים, אך לא לאחרים. ^12,13 ו Millonas Hanck הציע הסיבה תדרים מסוימים לא לייצר את התגובה הצפויה היא הנוכחות של קבועי קצב מרובים במודל מרקוב. ^​​12 מחקרים כגון אלה, כמו גם אחרים, הראו כי ישנם מקרים שבהם זרמים יוניים נמדד מתוך תעלות יונים תוך שימוש ספקטרוסקופיה עכבה לא מסכים עם תגובת תדר תיאורטי. זו אינה דאגה במחקר זה כי המטרה של השיטה במחקר זה היא לזהות תדרים לתאם עם משרעת הזרם העצמאי של הנחות היסוד של מעגל חשמלי הממברנה. Furtheremore, משרעת הנוכחי מחושב חלקים של הקלטות כי אין שום פונקציות רעש מוכנס לתוך אותם. מספר מחקרים אחרים גם הדגמים הנוכחי של תעלות יונים רבות בתערוכה מדינות רבות בניהול ולא כל הולכה עם קבועי קצב משלהם. ^14,15,16 Thompson et al הראו כי פילטר הסלקטיביות של ערוץ KcsA יש אתרי קישור שונים עבור Na ^+, Li + ו K ^+, ואת העלויות האנרגטי של נעה מאתר אחד מחייב אחר כמו עובר יון דרך המסנן סלקטיביות היא מה שעושה ערוץ מעדיפים לנהל K ⁺ יונים דרך הנקבוביות שלה. ¹⁷ במאמר זה אנו מוכנס מגוון של תדרים (פונקציה רעש) לתוך פרוטוקול צעד מתח וחיפשתי תדרים אשר משרעת מאוד לתאם עם משרעת הזרם הכללי. מאז ראיות חזקות הוצגה מציע קבועים שיעור מספר לשחק תפקיד הולכה של יונים באמצעות בידולt ערוצים, המבוא של תדרים הקשורים בקבועים אלה קצב עלול לגרום תדרים מסוימים או להדהד מאוד לתאם עם משרעת הנוכחי, אשר לא היה אחרת. השיטה הוכיחה במחקר זה מבוצע על תא מודל, המהווה מעגל RC מקבילי אשר משמש בדרך כלל כדי לבדוק את המעגלים מהדק מתח וציוד הרכישה. זה לא צפוי כי כל התדרים מלבד הבירה היה לתאם עם גודל הנוכחי, וזה מוצג הנתונים שלנו. אנחנו גם מראים כי תוספת של הפונקציה הרעש לא גרם כל התדרים מאוד לתאם עם משרעת הנוכחי. אלה שני הממצאים הם קריטיים כי הם מראים כי ציוד המדידה פונקציה רעש לא בכוחות עצמם לגרום תדרים כל לתאם עם משרעת הנוכחי. כאשר מחקרים עתידיים לבצע מדידות באמצעות ממברנות המכילות תעלות יונים, צפוי כי, בהתאם לערוץ בשימוש, התדרים שמתאימים קבועים בשיעור במסנן סלקטיביות או אולי הנקבובית ישפיעו על תגובת התדר של ערוץ ולהשפיע אשר יש תדרים גבוהים או מתאם נמוך עם משרעת הנוכחי.

מאז שיטה זו היא שיטה חדשה ללימוד תעלות יונים, ישנם מספר כיוונים מחקרים עתידיים יכולים לעקוב. ראשית, השיטה צריכה לשמש כדי לאפיין את תגובת תדר של ערוצים מבודדים ספציפיים. עבודה נוספת גם צריך לעשות כדי לכייל את התדר אמפליטודות של אמפליטודות הנוכחי. לאחר מספר ערוצי מאופיינים בנפרד, סוגי ערוצים מרובים יש למדוד בו זמנית. הטכניקה יכולה להיות גם מותאם לשימוש מהדק פעולה פוטנציאליים, מהדק הנוכחית, גירוי מחקרים בתחום. בזמן הזה היא טכניקה חדשה, זה מראה מה יכול להיות דרך רבת עוצמה כדי לבצע מדידות אלקטרו כי היו בעבר לא אפשרי לספק תובנות חדשות רבות ערך התפקיד הפיזיולוגי של תעלות יונים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matlab	Mathworks	n/a	Natick, MA
Clampex 8	Molecular Devices	Clampex 8	Sunnyvale, CA
Integrating Patch Clamp Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200	Sunnyvale, CA
Headstage	Molecular Devices	CV202	Sunnyvale, CA
16-Bit Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Sunnyvale, CA
Model Cell	Molecular Devices	Patch 1 Model Cell	Sunnyvale, CA