פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Summary

הפיתוח של מבחני אישית על פלטפורמה VIBE עבור רגישים יותר, תוצאות לשעתקו אוטומטיות מטריצות מורכבות מתואר. מחסנית האוניברסלי מאפשר מבחני להיות מותאם בקלות לשימוש עם מבחני אישית. גמישות זו מאפשרת אימות פיתוח מהיר של מבחני רומן או בגרסאות אוטומטיות של מבחני ידנית הקיימת, מדגים בסרטון הזה.

Abstract

מבחני התאמה אישית של חלבונים ייחודיים מוגבלים לעיתים קרובות בזיהוי זמן רב ידני וטכניקות quantitation כגון ELISA או כתמים המערבי בשל המורכבות של פיתוח על גבי פלטפורמות חלופיות. ממברנה אקוסטית הקניינית של BioScale microparticle (AMMP) הטכנולוגיה מאפשרת immunoassays כריך להתפתח בקלות לשימוש בפלטפורמת VIBE, מתן רגישות יותר, שחזור, והפעלה אוטומטית. בתנאי כדוגמה, פרוטוקול זה מתאר את הליך לפיתוח אוגר מנהג סינית השחלות-Cell Host חלבון (CHO-HCP) assay. העקרונות הכלליים שהותוו כאן ניתן בעקבות לפיתוח מגוון רחב של immunoassays.

Assay מודד AMMP אנטיגן ריכוז ידי מדידת השינויים בתדירות תנודה הנגרמת על ידי קשירה של microparticles אל פני השטח את חיישן לחשב. היא מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: (1) מחסנית המכילה שבב פונקציונליות eight חיישן (2) שכותרתו נוגדן microparticles מגנטי, (3) נוגדנים hapten מתויג שקושר אל פני השטח של שבב פונקציונליות (4) דגימות המכיל את האנטיגן של עניין. Biosensor של BioScale הוא מכשיר התהודה זה מכיל שמונה ממברנות הפרט עם fluidic נתיבים נפרדים. ממברנות שינוי תדר תנודה בתגובה צבירת מסה על פני השטח, וזה שינוי תדר משמש לכמת את כמות המסה הוסיף.

כדי להקל על השימוש במגוון רחב של immunoassays החיישן פונקציונליות עם נוגדן אנטי hapten. נוגדנים ספציפיים Assay משתנים דרך נטיה קוולנטיים של תג hapten על נוגדן אחד ביוטין השני. התווית ביוטין משמש כדי לאגד את הנוגדן streptavidin בשילוב חרוזים מגנטיים, אשר בשילוב עם נוגדנים hapten-מתויג, משמשים כדי ללכוד את אנליטי בתוך כריך. הקומפלקס נקשר השבב דרך האינטראקציה anti-hapten/hapten. בסוף כל assay להפעיל את החיישנים מנקים עם חומצה לדלל המאפשר ניתוח רציף של עמודים מתוך צלחת 96-היטב.

כאן, אנו מציגים את השיטה לפיתוח assay אישית CHO-HCP AMMP לפיתוח Bioprocess. פיתוח מבחני AMMP או שינוי מבחני הקיימים מבחני AMMP יכול לספק ביצועים טובים יותר (, רגישות reproducibility) בדגימות מורכבות הזמן מפעיל מופחת. פרוטוקול מראה את הצעדים לפיתוח בסעיף דיון ביקורות תוצאות נציג. לקבלת הסבר מעמיק יותר של אופטימיזציה assay ופרמטרים התאמה אישית מגע BioScale. ערכה זו מציעה הגנרית מבחני Bioprocess פיתוח כגון חלבון שיורית titer, מוצר, ואת CHO-HCP.

Protocol

1. Microparticle הכנה

1. לייבל נוגדנים באמצעות ביוטין NHS לכימיה
2. קביעת מידת Biotinylation
3. המצומד streptavidin חרוזים עם נוגדן Biotinylated
   1. Resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing במשך 1-2 דקות
   2. Aliquot נפח הרצויה של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge
   3. שטפו את החרוזים 3 פעמים עם PBST:
      1. מניחים את הצינור המכיל את החרוזים על המגנט במשך 2 דקות
      2. הסר את supernatant על ידי שאיפה עם הצינור על המגנט. היזהר שלא לשבש את החרוזים
      3. הוצא את הצינור מתוך המגנט ולהוסיף 1 מ"ל PBST
      4. וורטקס למשך 20 שניות כדי resuspend את החרוזים
      5. צנטריפוגה למשך 5 שניות כדי להסיר את החרוזים מן הכובע
      6. חזור 2.3.1-2.3.5 עוד פעמיים
   4. לאחר המקום השלישי לשטוף בצינור על המגנט לשאוב PBST
   5. הוסף נוגדן biotinylated על חרוזים resuspend
   6. אם יש צורך להביא את עוצמת הקול של הנוגדן biotinylated עד 300 μL עם PBS. אם נפח נוגדן כבר יותר מ 300 μL אין להוסיף כל PBS
   7. לדגור על השעיית חרוז / נוגדנים במשך 30 דקות ב RT על שייקר מערבולת או rotator צינור
   8. לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3.
   9. בלוק עם חרוזים BSA biotinylated
      1. לאחר לשטוף third להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ג biotinylated BSA, להתאים את עוצמת הקול כדי μL 300 עם PBS במידת הצורך, דגירה עם תסיסה במשך 30 דקות
   10. לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3
   11. Resuspend את החרוזים μL 100 של BSA PBS/0.05%. אזיד הנתרן ניתן להוסיף לאחסון ארוך טווח
4. שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים NHS והעמסת, fluoresceinate את הנוגדן גלאי
5. לקבוע את מידת Fluorescination

2. HCP - פיתוח

1. הכינו פתרונות עבודה:
   1. נוגדנים והעמסת שכותרתו (FL-AB): רוב CHO-HCP מבחני להשתמש Fl-Ab בריכוז הסופי של 400 ng / mL. Fl-Ab יתווסף ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון עובד הוא 1.6 מיקרוגרם / מ"ל. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות flab עם BioScale ביד / flab diluent.
   2. חרוזים: רוב CHO-HCP מבחני להשתמש חרוזים בריכוז הסופי של 2x10 ⁵ חרוזים / mL. מגיב חרוז מהווה ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון הוא לעבוד 8x10 ⁵ חרוזים / mL. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות חרוז עם BioScale ביד / flab diluent. וורטקס המניות חרוז היטב כדי לוודא את כל החרוזים נמצאים ההשעיה לפני הסרת aliquot.
   3. הפעלת מאגר: הרכב למאגר פועל עשויה להיות מותאם במיוחד את הנוגדנים המשמשים לפתח את assay, אולם מספר CHO-HCP מבחני פותחו באמצעות 10 mM HEPES חיץ, 1% Tween, pH 7.5. BioScale פיתחה תוסף עבור למאגר פועל (מסופק עם ערכת פיתוח) אשר מתווסף למאגר ריכוז של 1% לפני השימוש.
2. מדולל הכיול דגימות עם diluent לדוגמה BioScale.

3. VIBE מערכת הגדרת

1. סובבו את Workstation על VIBE
2. חבר את אספקת מערכת ופסולת
3. ראש מערכת
4. הכנס מחסנית VIBE
5. מסלול הצינורות
6. הכן תבנית assay על ידי מילוי דף שכותרתו "הגדרת דוגמה". BioScale מספק יכולת יש תבנית אחת assay assay עבור כל תחנת עבודה VIBE. זה מאפשר למשתמש לערוך ולשמור מציין ספציפית את גליון "הערות" של תבנית עבור מבחני שונות שמירה תיעוד מלא של הניסוי.
7. תבנית assay ראשוניים להגדיר: התחל על ידי מילוי טבלה (בפינה השמאלית העליונה) של טווח ריכוז של סטנדרטים assay של הגיליון "הגדרת דוגמה".
8. בשלב הבא, להזין מידע נוסף בטבלה בצד ימין של הסטנדרטים (Setup טור פשוט קרא, אחת הוסף מגיב ואת שני setups מגיב הוספה) להורות Workstation VIBE כמה דגימות ארוך צריך לדגור, כמה נפח הוא מגיב שיועברו , כמה זמן את הצטברות מדגם צריך להיות, והאם מיזוג חיישן טיהור של בדיקות דיו נחוצים, וכו '
9. מלאו את הצלחת הפריסה.
10. טען מדגם / ריאגנטים לתוך הצלחות. VIBE יספק את הכרכים הדרושים צלחת מגיב. נפח לדוגמה יכול להשתנות, אבל במחצית של נפח assay סך של 120 μL היא מקום התחלה טובה.
11. החל מכסה צלחת. טען צלחות לסיפון תחנת עבודה.
12. הפעל את assay להתחיל את האשף, לעבור את האשף ולהתחיל assay.

4. נציג תוצאות

איור 1: immunoassay AMMP סנדוויץ

בתחנת עבודה VIBE, assay AMMP אמצעים ריכוז אנטיגן. אותות נמדד כאשר נוגדן אנטיגן חרוז-hapten נקשר החיישן דרך hapten / אנטי hapten אינטראקציה. התחדשות מביא את החיישן בחזרה למצב ההתחלה ידי הסרת מתחמי החיסונית.

איור 2: CHO-HCP AMMP עקומת כיול Assay

איור 2 לעיל הוא דוגמה של עקומת HCP CHO AMMP כיול Assay. ניתוח ניתן לבצע דגימות מכל רחבי הנחל לטיהור כולל הכור בדייקנות reproducibility גבוהה.

איור 3: חלבון עקומת כיול AMMP Assay

איור 3 הוא עקומת כיול של חלבון שיורית Assay AMMP, הופיע עם חלבון VIBE שיורית ערכת Assay. הערכה דומה ניתן להשתמש assay מהיר עם תקופת דגירה 30 דקות, או לתוצאות יותר רגיש טווח דינמי רחב יותר עם תקופת דגירה זמן רב יותר ללא איבוד של דיוק או דיוק, אשר שניהם הם בדרך כלל טוב יותר מאשר המקבילה ELISA של משתמשים רשומים " ידיים

איור 4: מוצר titer AMMP Assay

Workstation VIBE יכול לשמש גם עבור assay מוצר titer, התוצאות שמוצג בתרשים 4. בביצוע שונה מאשר מבחני AMMP אחרים, assay זה אינו מחייב טיפול מדגם אחר מאשר דילול פשוט, או חרוזים quantitation אומת ב "שום ספין" דגימות המכיל מעל 10 מיליון תאים על פני מגוון רחב של viabilities.

איור 5: סטנדרטי AMMP Assay עקומת עבור assay GST-Gadd34 סמן ביולוגי

שמוצג באיור 5 היא עקומת תקן של האות המתקבל על ידי BioAnalyzer VIBE (לוח א ') או באמצעות טכנולוגיה AlphaScreen רקומביננטי GST-Gadd34. תוצאות בפלטפורמת VIBE היו כ יומן רגיש יותר באמצעות נוגדנים אותו. AMMP ממנף את המדידה של חלקיקים גדולים יותר פחות, אך עדיין נהנית ללכוד פתרון שלב ומורכב היווצרות זיהוי.

איור 6: עקומת AMMP Assay תקן GST-Gadd34 במדגם הגידול

באיור 6, אינדוקציה של Gadd34 מ CWR22 xenografts נבדק נוכחות או היעדר של מעכבי פרוטאזום boronate כמו מנותח על ידי אחד BioAnalyzer VIBE (לוח א ') או AlphaScreen (לוח ב'). הפלטפורמה VIBE היה מסוגל לייצר רגיש, תוצאות לשעתקו ב xenografts הגידול vivo ואילו האות AlphaScreen היה הרווה עם מיקרוגרם מוגברת של חלבון.

דוגמה זו מראה את הכוח של הטכנולוגיה AMMP בדגימות מורכבות ביותר. בשל שבב זיהוי רגיש יעילות גבוהה של המגנט ליד הצ'יפס, המספרים הנמוכים של microparticles מגנטי יכול ביעילות reproducibly לחפש עבור מטרה שפע נמוך בתוך המורכבות של lysed הסלולר (כולל ריאגנטים תמוגה) ופסולת דם.

Discussion

הדוגמאות לעיל להפגין רגישות גבוהה של AMMP תוצאות כמותיות בדגימות מורכבות. זה ביצועים, כאשר נמסר בקלות ובקרה של עיצוב ריאגנטים לתוך המערכת מאפשרת עבור מגוון של יישומים. יישומים אלה עשויים להיות מטרה ספציפית, כמו Gadd34 בגידול, או גנרי למגוון מטרות, כמו זיהוי התא המארח quantitation חלבון בדגימות כי לחצות את הנחל טיהור. תקורה נמוכה VIBE פלטפורמה בשילוב עם AMMP גמישה מספק כלי רב עוצמה להעברת מבחני קריטי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads	BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes	New England Biolabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent	BioScale		to dilute beads and FlAb
Sample Diluent	BioScale		to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive	BioScale