ספירת אדם בתאי גזע עצביים

Summary

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא נדרש מניפולציות תרבות רבים רקמות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאים חיים ומתים ולכמת תאים באמצעות hemacytometer. למרות שזה מתאר הספירה האנושית גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), ניתן להשתמש בו עבור סוגי תאים אחרים.

Abstract

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא בנפח נתון של השעיה תא נדרש הרבה רקמות שגרתי מניפולציות תרבות, כגון תאים ציפוי עבור immunocytochemistry או transfections התא. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ומהירה הבחנה בין תאים חיים ומתים לכימות ריכוז תאים מספר התאים הכולל שימוש hemacytometer. פרוצדורה זו הראשונה מחייבת ניתוק תאים ממשטח צמיחה resuspending אותם בתקשורת. לאחר מכן, התאים בדילול בתמיסה של Trypan כחול (אידיאלי ריכוז זה ייתן 20-50 תאים לכל רביע) והושמו hemacytometer. לבסוף, מונה בממוצע של תאים קיימא הרביעים שנבחרו באקראי מספר, חלוקת הממוצע לפי נפח של אחד 1 מ"מ ² ברבע (0.1 μl) ו הכפלה במקדם דילול נותן את מספר התאים לכל l. הכפלה זו על ידי ריכוז תא מהנפח הכולל של μl נותן את מספר התא הכולל. פרוטוקול זה מתאר סופר אנושי גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), אך יכול לשמש גם עבור הרבה סוגי תאים אחרים.

Protocol

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

הערה: אנא עיין Passaging אדם בתאי גזע עצביים מאמר על איך לנתק ו resuspend התאים. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

הכנת תרחיף תאים עבור ספירת

1. מקום 25 μl של 0.4 פתרון Trypan% כחול 20 μl של המדיה הנייד לתוך צינור Eppendorf.
2. Resuspend את התאים ייספרו בעדינות על ידי הקשה על שפופרת המכילה תאים בנפח ידוע של התקשורת ליצור השעיה הומוגנית. מקום 5 μl של תאים לתוך הצינור Eppendorf מהשלב הקודם. צעד זה מדלל את ריכוז תא בפקטור של 10.
3. הנח את הזכוכית המכסה על hemacytometer, ואת העומס על μl 11-12 ההשעיה התא.
   
   
   
   

ספירת תאים Hemacytometer

1. שים את הרשת כולה hemacytometer של מיקרוסקופ לעומת שלב. התמקדות ברבע אחד לרשת (כגון אחד באדום).
   
   
   
   
2. תאים מתים או גוססים יופיעו כחול כי הממברנה שלהם נפגע והם אינם מסוגלים להוציא את הצבע הכחול Trypan. תאים חיים לא יופיע בכחול ויהיה מוקף "הילה" של אור בניגוד שלב (יהיה "שלב בהיר").
3. ספירת התאים קיימא ברבע אחד (אזור 1 מ"מ ^2). אתה יכול גם לקבוע כדאיות התא על ידי חלוקת מספר התאים קיימא על ידי המספר הכולל של תאים. ספירת התאים הרביעים אקראי 3-4 ולקבוע את המספר הממוצע של התאים לכל ברבע. מאז נפח ברבע ידוע להיות 10 מ"ל ^-4 או 0.1 μl, ריכוז של תאים ניתן לקבוע
   
   
   
   
   
   
4. אתה יכול להשתמש את קיצור הדרך הבא כדי לקבוע את התאים # / μl:
   
   
   
   סך # של התאים בצינור = # תאים / X μl μl בצינור

Discussion

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה ומהירה על מנת לקבוע את ריכוז התא עבור מגוון של ניסויים הכוללים תאים. באמצעות קיצור הדרך המתוארת 3d, ניתן במהירות ובאופן מדויק לקבוע את ריכוז התאים מספר התא הכולל נפח נתון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phase Contrast Hemacytometer	Tool	Hausser Scientific	02-671-54	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4%	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #