A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.
Immunocytochemistry היא שיטה חזקה מאוד פשוטה למדי לקביעת נוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן של עניין, בדרך כלל חלבון, בתאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו לחוקרים כדי לחסוך נוגדנים ראשוניים ומשניים תוך קבלת איכות גבוהה, איכותי לשחזור נתונים כמותיים מתוך מכתים שלהם. ישנם שני היבטים של פרוטוקול זה מסייע לשמר את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי מכתים. ראשית, התאים גדלים על, coverslips קטן עגול ממוקמים בארות צלחת בתרבית רקמה. לאחר קיבוע, התאים על coverslips ניתן להסיר את הבארות של הצלחת. עבור מכתים נוגדן, coverslip עם תאים הוא הפוך על ירידה קטנה של פתרון נוגדן על parafilm והוא מכוסה בחתיכת השני של parafilm כדי למנוע התייבשות. באמצעות שיטה זו, רק ~ 25 μl של פתרון נוגדן דרוש coverslip כל (או מדגם) להיות מוכתם. פרוטוקול זה מתאר immunostaining של האדם גזע / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), אך יכול לשמש הרבה סוגי תאים אחרים.
יום 1: הכנת תאים Coverslips זכוכית הגרמנית מתזמן
הערה: coverslips זכוכית הגרמני לעיתים קרובות עדיף העיקרי culturing בתאי גזע עצביים ועל נוירונים. אנו משתמשים בפרוטוקול ניקוי הבאות כדי לשפר את הידבקות התא מתפשטת. מיקום coverslips במעמד קטן שיאפשר גישה נוזל על שני הצדדים של coverslip. ראשית, coverslips דגירה Liquinox ב 1% למשך 10 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. ודא כי אין בועות סבון להישאר. בשלב הבא, תלושי דגירה ב 1M HCl למשך 30 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. Coverslips יבש ב 65 ° C במשך הלילה. העברת coverslips על צלחת זכוכית החיטוי לעקר.
יום 2: תיקון, Permeabilizing, חסימה, ואת הוספת נוגדן ראשוני לתאי
הערה: אנו משתמשים מקבע הבאים paraformaldehyde 4% כדי לשמור על מורפולוגיה התא. המתכון כולל המעבר pH לאפשר paraformaldehyde להיכנס פתרון. אנחנו מעדיפים את השיטה ולא את השימוש של חום לפזר paraformaldehyde בגלל טמפרטורות גבוהות יותר יכול להוביל לדור של חומצה פורמית, אשר יכול להגביר מכתים הרקע בעת שימוש פלואורסצנטי. רכיבים מסוימים של מקבע לעזור לשמר את מבנה cytoskeletal (MgCl 2 ו EGTA), בעוד אחרים לעזור לשמור על המורפולוגיה הכללית (סוכרוז).
Paraformaldehyde מקבע 4% עבור תאים
ריאגנטים את הפעולות הבאות: | עבור סכום של 100 מ"ל מקבע: |
MilliQ מים | 75 מ"ל |
Paraformaldehyde (שוקל לצאת למכסה המנוע קטר) | 4 גרם |
10N NaOH, מערבבים ומוסיפים dropwise עד פתרון מנקה | לפי הצורך |
10X PBS | 10 מ"ל |
1M MgCl 2 | 0.5 מ"ל |
0.5 מ EGTA | 2 מ"ל |
סוכרוז | 4 גרם |
HCl 6N, לכיל ל-pH 7.4 | לפי הצורך |
MilliQ מים | מביאים 100 מ"ל |
חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1. חם על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש |
לדלל את הנוגדן הראשוני (בתקווה שהוא ספציפי לחלבון ריבית) לריכוז שנקבע מראש 1% BSA / PBS (שהוכן על ידי דילול מ -5% BSA / PBS). המקום בדילול נוגדן ראשוני (30 μl לכל coverslip 25 מ"מ, 20 μl לכל coverslip 18 מ"מ, 15 μl לכל coverslip 12 מ"מ) על צלחת זכוכית מכוסה parafilm. תרימי את coverslip עם תאים קבוע, להפוך כך התאים עם הפנים כלפי מטה, ולהניח אותה על הפתרון נוגדן כך התאים באים במגע עם הנוגדן. מניחים רצועה parafilm השני מעל לבנות את כולו. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
יום 3: כביסה, דגירה נוגדן משנית, כתמים גרעיני הרכבה
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
פרוטוקול זה מתאר את הליך immunostaining עבור hNSPCs זה ממזער את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי ונותנת מכתים תא אמין. ההליך המתואר הוא הטוב ביותר עבור אנטיגנים תאיים, אך ניתן לשנות כתם פני התא מולקולות או כדי לשפר כתמים של cytoskeleton.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
המחברים רוצים להכיר ד"ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג' קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC ד"ר גארי Bassell באוניברסיטת אמורי להוראה הראשונית בטכניקת צביעה parafilm.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma-Aldrich | Z273279 | very viscous |
Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P7280 | |
Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
24 well plate | Tool | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
Triton X-100 | Reagent | Fisher Scientific | BP151-500 | very viscous |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
H–chst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved